玳玳花精油的成分及其抗氧化活性研究

苏 瑾 潘兆平 肖 媛 梁曾恩妮,3 付复华,3

(1. 湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2. 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；3. 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125)

玳玳是芸香科柑橘属酸橙的一个变种，广泛种植于中国长江以南地区。玳玳花是一种药食兼用资源，具有理气宽胸、开胃止呕、活血调经、缓解抑郁、焦虑等精神系统疾病的功效[1-3]。研究[4]表明，玳玳花中含有精油、黄酮和生物碱等活性物质，此外还含有多种苷类化合物及丰富的维生素类、人体必需氨基酸、纤维类、香豆素类以及矿物质类等。但玳玳花花期很短，不利保存，因此可将玳玳花加工成精油，高效利用资源，增加其经济价值。

研究[5-6]发现，癌症、炎症及衰老等备受关注的健康问题均与机体的氧化损伤相关。由于当前合成类抗氧化药物的高毒副作用和耐受性等安全问题，寻找新型高效、低毒且耐受性好的抗氧化剂对于临床研究具有重要意义。玳玳花精油作为玳玳花主要的香气、活性成分，资源丰富、天然安全，具有很好的抗氧化潜力，日益受到人们的关注与欢迎，然而其理化性质及抗氧化活性鲜见报道。试验拟对玳玳花精油的成分、理化性质和抗氧化能力进行研究分析，以期为玳玳花精油在天然抗氧化剂及食品保鲜、护肤等方面的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

玳玳花：涟源康橙生物科技有限公司；

无水乙醇、浓硫酸、磷酸钠、钼酸铵、过硫酸钾、七水硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢等：分析纯，国药集团化学试剂公司；

VC标准品、DPPH、ABTS：分析纯，上海瑞永生物科技有限公司。

1.1.2 仪器

气相色谱—质谱联用仪：7890A-5975C型，美国Agilent公司；

紫外—可见分光光度计：UV-1800型，岛津仪器(苏州)有限公司；

折光仪：Abbemat 200型，奥地利安东帕(中国)有限公司；

旋光仪：MCP 500型，奥地利安东帕(中国)有限公司；

水浴恒温振荡器：SHA-B型，常州澳华仪器有限公司；

多功能粉碎机：RS-FS1401型，合肥荣事达小家电有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玳玳花精油的提取 将新鲜玳玳花去除杂质后用粉碎机粉碎，放入挥发油提取器中隔水蒸馏提取，2 h后精油馏出量不再增加，收集精油用无水硫酸钠干燥过夜后，-20 ℃密封保存。

1.2.2 GC-MC分析条件 参考吕品等[7]的方法略有改动。

(1) 色谱条件：色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯度氦气，分流比为10∶1，流速1 mL/min；进样量1 μL，进样口温度250 ℃，检测器温度280 ℃；升温程序：起始温度70 ℃，保持1 min，3 ℃/min升温至150 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min 升温至220 ℃，然后1 ℃/min升温至236 ℃，再以2 ℃/min升温至240 ℃，保留13 min；溶剂延迟4 min。

(2) 质谱条件：EI源，电离电压70 eV，离子温度230 ℃，扫描范围50～500 (m/z)。

1.2.3 精油理化指标分析 对玳玳花精油的色状、香气、相对密度、折光指数、旋光度、溶混度、酸值、酯值等理化指标进行测定，分析方法参照QB/T 4232—2011。

1.2.4 总抗氧化能力测定 采用磷钼络合法[8-10]。用无水乙醇稀释精油得到质量浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/mL的精油—乙醇溶液。取0.4 mL样品液和4 mL磷钼试剂(含0.6 mol/mL硫酸、28 mol/mL磷酸钠和4 mmol/mL钼酸铵)于干净试管，摇匀后在95 ℃恒温加热90 min，冷却至室温后，在695 nm下测定吸光值。相同浓度的VC溶液为阳性对照，用0.4 mL无水乙醇代替样品液作空白。相关操作重复3次。

1.2.5 DPPH自由基清除率测定 根据文献[11-12]修改如下：取19.716 mg DPPH于500 mL容量瓶中，加乙醇定容，得到0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液。2 mL不同浓度样品液与2 mL DPPH溶液混合后，避光反应30 min，517 nm下测定吸光值Ai，2 mL乙醇代替样品液测得吸光值A0，VC作为阳性对照。平行操作重复3次，清除率按式(1)计算：

(1)

式中：

R——清除率，%；

A0——乙醇代替样品测得吸光值；

Ai——样品组吸光值。

1.2.6 ABTS自由基清除率测定 将等体积的7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光12～16 h，无水乙醇调节734 nm下吸光度为0.68～0.72，得到ABTS储备液。将1 mL不同浓度的样品液与2 mL上述储备液混合后暗处反应30 min，734 nm处测定吸光值Ai，无水乙醇代替样品液测得A0，相同浓度VC为阳性对照。每组测定重复3次，按式(1)计算清除率[13-14]。

1.2.7 羟基自由基清除率测定 用无水乙醇将精油稀释成系列浓度梯度，取2 mL不同浓度精油样品液加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1 mL水杨酸—乙醇溶液和0.2 mL H2O2溶液，充分混匀，37 ℃水浴30 min后，510 nm 下测定吸光值为Ai，无水乙醇代替样品液相同方法测得A0，蒸馏水代替H2O2测得Aj。等浓度VC为阳性对照。每组测定重复3次，清除率按式(2)计算[15]：

(2)

式中：

R1——清除率，%；

Ai——样品组吸光值；

Aj——蒸馏水代替H2O2测得吸光值；

A0——乙醇代替样品测得吸光值。

2 结果与分析

2.1 玳玳花精油的GC-MS分析

GC-MS分析玳玳花精油的总离子流图见图1，通过计算机检索与NIST 08图谱库标准图谱对比，判定精油中各化学成分，运用面积归一化法进行相对定量，结果如表1所示，共鉴定出41种成分，占总成分95.80%，其中包括13种醇类化合物，占总成分59.34%，16种萜烯类化合物，占22.82%，4种烷烃类化合物、3种酸、3种酯类、1种吲哚和1种酚类化合物(详见表1)。这些化合物是玳玳花精油特征香气和生物活性的主要贡献者。

含量超过1%的共13种，含量最高的为3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇(34.27%)，是一种无环单萜芳樟醇；其次是柠檬烯，占总成分的13.02%，具有柠檬香气，与刘廷礼等[16]测得的结果相似；α，α-4-甲基-3-环己烯-1-甲醇(7.48%)又称α-松油醇，有丁香味，是调配丁香型香精的主要原料；2-氨基苯甲酸酯-3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇占6.58%；(E)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯(6.04%)和(Z)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯(3.39%)属于橙花乙酸酯，是国家允许的食用香精，常用以配制苹果、桃子及柑橘类等水果型香精；(E)-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3-醇(3.09%)；(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛二烯(2.94%)；(1S)-6，6-二甲基-2-亚甲基-双环[3.1.1]庚烷(2.35%)；3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯-1-醇(2.14%)；(E)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇(2.02%)又称香叶醇，是玫瑰香精的主剂，也可作增甜剂添加于食品中；石竹烯(1.63%)；(Z)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇(1.25%)别名橙花醇，有令人愉悦的香气，是国标允许的食用香精，可用于食品和化妆品香精的调制。

图1 玳玳花精油成分总离子图

Figure 1 Total ion chromatograms of essential oil extracted fromCitrusaurantiumL.var.amaraEngl

表1 玳玳花精油化学成分

柠檬烯是柑橘属精油最常见的主要成分，已被广泛报导有良好的抗氧化抑菌作用[17-18]，常用于食品的防腐保鲜。松油醇可抗菌、抑制肿瘤细胞生长，Gouveia等[19]最近还发现α-松油醇可以通过调节氧化应激和抑制iNOS来减轻癌症疼痛。孙丰慧等[20]通过抑菌试验发现香叶醇有明显的体外抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，且能够增强β-内酰胺类抗生素的活性，降低其用量。香叶醇还可以通过抑制癌细胞增殖，诱导其凋亡来抑制癌细胞的转移与浸润。石竹烯在许多神经系统相关疾病中起到保护作用，包括疼痛、焦虑、痉挛、惊厥、抑郁、酗酒和阿尔茨海默症等，此外还具有局部麻醉剂样活性，可以保护神经系统免受氧化应激和炎症，并可作为免疫调节剂。

2.2 玳玳花精油的理化性质

水蒸气蒸馏法提取的玳玳花精油为琥珀色澄清液体，保留了玳玳花的特征香气。由表2可知，在20 ℃条件下测得相对密度为0.872，折光指数1.463，旋光度为11.230，精油在溶于3.5倍体积80%乙醇时仍然澄清透明，测得酸值为0.59 mg KOH/g，酯值为52 mg KOH/g，以上指标均达到玳玳花(精)油中国轻工行业标准QB/T 4232—2011要求。

表2 玳玳花精油的理化性质

2.3 玳玳花精油的抗氧化能力

2.3.1 总抗氧化能力 磷钼络合法测定精油的总抗氧化能力，吸光值越高，总抗氧化能力越强。由图2可知，在0.2～10.0 mg/mL浓度范围内，玳玳花精油的总抗氧化能力随着浓度的增加而增强。低浓度时VC与精油的总抗氧化能力均随浓度的升高显著上升，但精油低于VC，VC在浓度2 mg/mL以后抗氧化活性不再随浓度变化而明显改变，4 mg/mL时精油的抗氧化活性超过VC，并且有继续增强的趋势，可能是由于VC成分单一，达到作用上限后VC的总抗氧化能力不再增加，而精油中活性成分复杂，随着精油浓度升高，更多活性成分累积，总抗氧化能力更强。

图2 玳玳花精油总抗氧化能力

Figure 2 Total antioxidant capacity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.2 DPPH自由基清除能力 由图3可知，在10～50 mg/mL 浓度范围内，玳玳花精油清除DPPH自由基的能力呈剂量依赖性增强，浓度为50 mg/mL时清除能力达到73.51%，且有继续增长的趋势，IC50值为32.3 mg/mL， 但与VC相比，玳玳花精油清除DPPH自由基能力较弱。Choi等[21]测得尤力克柠檬、里斯本柠檬等34种柑橘类精油对DPPH自由基的清除率为17.7%～64.0%，低于同浓度的γ-萜品烯，高于d-柠檬烯和α-松油醇，且γ-萜品烯含量越高的精油有越强的DPPH自由基清除能力。说明柑橘属精油中清除DPPH自由基的主要作用成分是γ-萜品烯，而玳玳花精油中未检测出γ-萜品烯可能是其对DPPH自由基清除能力较弱的原因。

图3 DPPH自由基清除能力

Figure 3 The DPPH scavenging activity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.3 ABTS自由基清除能力 由图4可知，在2～10 mg/mL 浓度范围内，玳玳花精油对ABTS自由基清除能力随精油浓度增加而增强，浓度为2 mg/mL时清除率为42.94%，浓度为10 mg/mL时清除率达到85.63%，并且有继续增长的趋势，IC50值为2.78 mg/mL。结果表明玳玳花精油具有良好的清除ABTS自由基能力。

图4 ABTS自由基清除能力

Figure 4 The ABTS scavenging activity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.4 羟基自由基清除能力 由图5可知，各浓度VC对羟基自由基的清除率均超过90%以上。2 mg/mL的玳玳花精油对羟基自由基的清除能力较弱，清除率仅为20%；在2～10 mg/mL浓度范围内，玳玳花精油对羟基自由基的清除能力随浓度升高而增强，当浓度增加到10 mg/mL 时，玳玳花精油对羟基自由基的清除率达到94.87%，接近于同浓度VC的清除活性。玳玳花精油的清除羟基自由基的IC50值为4.96 mg/mL。章斌等[22]研究柠檬果皮精油不同组分的抗氧化活性时发现柠檬烯和α-松油醇等成分对羟基自由基的清除作用均随浓度增大而增强，它们协同增加精油的自由基清除作用，与试验结果相似，且在高浓度时α-松油醇相比其他成分对羟基自由基有更好的清除效果，试验中高浓度时玳玳花精油的清除效果更佳，可能与α-松油醇含量较高而α-松油醇在高浓度时贡献权重更大有关。

图5 羟基自由基清除能力

Figure 5 The Hydroxyl scavenging activity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.5 玳玳花精油的抗氧化能力对比 玳玳花精油清除自由基能力的回归方程和IC50值如表3所示，对3种自由基都有一定清除能力，对DPPH自由基清除能力较弱，IC50值为32.30 mg/mL，清除ABTS和羟基自由基的IC50值分别为2.78 mg/mL和4.96 mg/mL，清除自由基能力的排序为：ABTS自由基>羟基自由基>DPPH自由基。

表3玳玳花精油的抗氧化能力对比

Table3ComparisonoftheantioxidantofCitrusaurantiumL.var.amaraEnglessentialoil

抗氧化能力回归方程R2IC50值清除DPPH自由基Y=1.274 7x+8.8330.998 032.30清除ABTS自由基Y=5.163 5x+35.6710.977 72.78清除羟基自由基Y=9.757 5x+1.6290.979 94.96

3 结论

试验采用水蒸气蒸馏法提取出的玳玳花精油呈琥珀色澄清液体，具有玳玳花特征香气，通过GC-MS检测分析出41种化合物，含有大量醇类、萜烯类和烷烃等芳香化合物，成分多样。

玳玳花精油具有良好的总抗氧化能力，在4 mg/mL时超过VC的作用效果；对DPPH自由基清除能力较弱，50 mg/mL时清除率为73.51%；在精油浓度为10 mg/mL 时ABTS和羟基自由基的清除率分别达到85.63%和94.87%，清除自由基能力的排序为：ABTS自由基>羟基自由基>DPPH自由基。综上所述，玳玳花精油是一种成分丰富，应用价值较高的天然产物，有良好的抗氧化活性，在天然抗氧化剂和抗氧化、抗衰老的药品、护肤品中有着广阔的应用前景与价值。