黄花草总黄酮超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究

许建本 苏秀芳 黄妹胶

(1. 广西民族师范学院化学化工学院，广西 崇左 532200；2. 广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室培育基地，广西 崇左 532200)

黄花草是山柑科药用植物，主要分布在热带及亚热带地区，在中国云南、广西和福建等地都有种植[1]，其种子可入药、榨油，鲜叶可用于治疗眼病[2]。目前有关黄花草的研究主要集中于药用价值及重金属胁迫下种子萌发等方面，如Parimaladevi等[3]研究了黄花草提取物对老鼠的止痛作用机制，周鑫磊[4]研究了Mn2+对黄花草种子萌发、幼苗生长等的影响及胁迫生理生化特征的变化，而关于黄花草有效成分及抗氧化方面的研究鲜见报道。黄酮类成分是普遍存在于植物体中的一种天然抗氧化剂，具有抗氧化[5]、抑菌[6]和抗病毒[7]等药理作用。目前提取植物体中总黄酮的常见方法有溶剂浸提法、酶辅助提取法和超声辅助提取法等，其中超声辅助提取法因具有简单、安全、高效等优点而备受关注[8]。

试验拟以黄花草为原料，采用超声辅助法提取黄花草中的总黄酮，优化其提取工艺条件，并研究黄花草总黄酮对·OH、DPPH·和亚硝酸盐的清除能力，以期为黄花草的研究及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄花草：摘自广西崇左市江州区市政府公园，经广西民族师范学院黄秋蝉教授鉴定为山柑科植物黄花草(CleomeviscosaL.)；

芦丁标准品：生化试剂，上海晶纯试剂有限公司；

无水对氨基苯磺酸：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

盐酸萘乙二胺：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：≥97.0%，阿拉丁公司；

氢氧化钠：分析纯，广东光华科技股份有限公司；

95%乙醇、30%过氧化氢、亚硝酸钠、硝酸铝、水杨酸、七水合硫酸亚铁等：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2 主要仪器设备

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子天平：JA1003N，上海精密科学仪器有限公司；

循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限责任公司；

可见分光光度计：7200型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

超声波清洗器：SG2200HPT型，上海冠特超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄花草的预处理工艺流程

黄花草洗净→电热鼓风干燥箱烘干(60 ℃)→粉碎→过筛(60目)→脱脂脱色(石油醚中浸泡、搅拌)→抽滤→烘箱干燥(50 ℃)→避光保存备用

1.2.2 黄花草总黄酮的提取 取1.000 0 g黄花草粉末，加入一定量乙醇溶液，充分混匀，设定提取功率，在一定温度下超声提取至指定时间，过滤，将滤液定容至50 mL容量瓶中，摇匀备用。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制 根据文献[9]，修改如下：先用70%(体积分数，下同)乙醇溶液配制0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，再准确吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mL 0.2 mg/mL芦丁标准溶液置于比色管中，用70%乙醇溶液定容，摇匀备用。吸取1.0 mL标准溶液于10 mL的比色管中，加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠溶液摇匀，静置6 min；随后加入0.3 mL 10%的硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min；再加入4.0 mL 4% 氢氧化钠溶液，然后用70%乙醇溶液定容至10 mL，摇匀后放置反应15 min，以70%乙醇溶液作为空白，于510 nm处测定溶液吸光度。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程为：A=10.882x-0.000 2，R2=0.999 7，说明在此浓度范围内，吸光度与芦丁标准品的浓度具有较好线性关系。

1.2.4 单因素试验设计

(1) 乙醇浓度：取1.000 0 g黄花草粉末，按料液比1∶20 (g/mL)分别与30%，40%，50%，60%，70%的乙醇混合，提取功率30 W，在60 ℃下超声提取20 min，分析乙醇浓度对总黄酮得率的影响。

(2) 料液比：取1.000 0 g黄花草粉末，分别按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)与50%乙醇混合，提取功率30 W，在60 ℃下超声提取20 min，分析料液比对总黄酮得率的影响。

(3) 提取功率：取1.000 0 g黄花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)与50%乙醇混合，提取功率分别为30，40，50，60，70 W，在60 ℃下超声提取20 min，分析提取功率对总黄酮得率的影响。

(4) 提取温度：取1.000 0 g黄花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)与50%乙醇混合，提取功率分别为40 W，分别在30，40，50，60，70 ℃下超声提取20 min，分析提取温度对总黄酮得率的影响。

(5) 超声时间：取1.000 0 g黄花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)与50%乙醇混合，提取功率分别为40 W，在50 ℃下分别超声提取20，30，40，50，60 min，分析超声时间对总黄酮得率的影响。

1.2.5 正交试验设计 在单因素试验基础上，以对总黄酮得率影响较大的4个因素设计L9(3)4正交试验，以黄花草总黄酮得率为评价指标，优化黄花草总黄酮提取工艺。

1.2.6 黄花草总黄酮得率的测定 吸取1.0 mL样品液于10 mL比色管中，按“1.2.3”方法测定吸光度，再根据式(1)计算总黄酮得率。

(1)

式中：

C——总黄酮得率，%；

m——黄花草提取液的质量浓度，mg/mL；

V——样品定容体积，mL；

N——稀释倍数；

M——黄花草干粉质量，mg。

1.2.7 黄花草总黄酮抗氧化活性测定

(1) 对羟基自由基(·OH)清除能力的测定：根据文献[10]，修改如下：分别在10 mL比色管中加入1 mL不同浓度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的黄花草总黄酮提取液，再加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，摇匀，然后加入2 mL 9 mmol/L水杨酸—乙醇溶液，充分摇匀，最后加入2 mL 8.8 mmol/ L H2O2，摇匀。静置30 min后，在510 nm处测定吸光度，VC作为阳性对照。对照组以蒸馏水代替H2O2。空白组以蒸馏水代替黄花草总黄酮提取液。按式(2)计算·OH清除率。

(2)

式中：

K1——·OH清除率，%；

A1——样品组吸光度；

A2——对照组吸光度；

A3——空白组吸光度。

(2) 对DPPH自由基(DPPH·)清除能力的测定：参照文献[11]。

(3) 对亚硝酸盐清除能力的测定：根据文献[12]，修改如下：分别在10 mL比色管中加入2 mL不同浓度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的黄花草总黄酮提取液，再加入5 mL pH 3.0的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液，1 mL 100 μg/mL 亚硝酸钠溶液，将混合物置于37 ℃的恒温水浴锅中1 h，取出，立即加入2 mL 4 mg/mL对氨基苯磺酸，摇匀，静置5 min，再加入1 mL 2 mg/mL盐酸萘乙二胺，用蒸馏水定容，摇匀，静置15 min后，在540 nm 处测定吸光度，VC作为阳性对照。空白组以蒸馏水代替黄花草总黄酮提取液。按式(3)计算亚硝酸盐清除率。

(3)

式中：

K2——亚硝酸盐清除率，%；

A——样品组吸光度；

A0——空白组吸光度。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excle (Office 2010)、Origin 8.5软件进行数据处理及分析。所有试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对黄花草总黄酮得率的影响 从图1可以看出，适当提高乙醇浓度，总黄酮得率增大。这是因为随着乙醇浓度增大，溶剂与黄酮类成分的极性越来越接近，黄花草细胞发生溶胀现象，有利于总黄酮溶出。当乙醇浓度为50%时，黄花草总黄酮得率达到最大。继续增加乙醇浓度，溶剂与黄酮类成分的极性差异增大，影响了黄酮类成分的溶解性[13]，而且黄花草中醇溶性杂质大量溶出，这些杂质与黄酮类成分竞争溶剂，导致总黄酮得率减小。因此，选择最佳乙醇浓度为50%。

图1 乙醇浓度对黄花草总黄酮得率的影响

Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.2 料液比对黄花草总黄酮得率的影响 从图2可以看出，随着料液比增大，黄花草总黄酮得率先增大后减小。这是因为在一个合适的料液比范围内，增加溶剂，黄花草细胞内总黄酮和溶剂的浓度差增大，加大了传质效率，有利于总黄酮溶出[14]，因此，总黄酮得率增大。当料液比为1∶15 (g/mL)时，总黄酮得率最大。继续增加料液比，溶剂量过大，超声辅助效果减小，还会加大非黄酮类成分的溶出，导致总黄酮得率减小[15]。因此，选择最佳料液比为1∶15 (g/mL)。

图2 料液比对黄花草总黄酮得率的影响

Figure 2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.3 提取功率对黄花草总黄酮得率的影响 从图3可以看出，提取功率在30～40 W范围时，黄花草总黄酮得率随着功率增大而增大。这是因为超声波具有机械波动作用和空化效应[16]，适当增加超声波功率，可以提高对黄花草细胞壁的破坏效果，有利于总黄酮溶出。当超声波功率为40 W时，总黄酮得率最大。继续增加功率，黄酮类成分结构被过强的超声波破坏，总黄酮得率下降。因此，选择最佳提取功率为40 W。

2.1.4 提取温度对黄花草总黄酮得率的影响 从图4可以看出，黄花草总黄酮得率随着温度升高呈先增大后减小的趋势，50 ℃时提取率达到最大。这是因为适当升高温度可以增加分子动能，加快分子运动，增强总黄酮的渗透扩散能力，使得总黄酮得率增大。当提取温度高于50 ℃ 时，部分不稳定黄酮类成分的结构被破坏，且在高温下乙醇易挥发，导致溶剂浓度降低，不利于总黄酮溶出[17]，使得总黄酮得率下降。综合考虑，选择最佳提取温度为50 ℃。

图3 提取功率对黄花草总黄酮得率的影响

Figure 3 Effect of extraction power on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

图4 提取温度对黄花草总黄酮得率的影响

Figure 4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.5 超声时间对黄花草总黄酮得率的影响 从图5可以看出，随着超声时间的延长，黄花草总黄酮得率先增大后减小。这是因为在20～50 min内，黄花草细胞壁逐渐被破坏，总黄酮从开始溶出至全部溶出，所以总黄酮得率逐渐增大。再继续延长时间，长时间地加热和超声会使溶出的总黄酮被氧化或分解，导致总黄酮得率下降。因此，选择最佳提取时间为50 min。

图5 超声时间对黄花草总黄酮得率的影响

Figure 5 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.2 正交试验

在单因素试验基础上，以料液比、乙醇浓度、提取功率和超声时间4个条件为考察因素，设计正交试验。提取温度取50 ℃，试验因素水平取值见表1，试验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

从表2可以看出，各因素对黄花草总黄酮得率的影响顺序为D>B>C>A，即：超声时间>乙醇浓度>提取功率>料液比。最佳提取工艺组合为A2B2C2D2，即料液比为1∶15 (g/mL)，乙醇浓度为50%，提取功率为40 W，超声时间为50 min。经3次平行实验验证，得到黄花草总黄酮得率为(2.711±0.002)%，说明通过正交试验得到的最佳工艺条件稳定性和重现性较好。

2.3 加标回收试验

取1.0 mL最佳提取条件下得到的黄花草提取液3份，分别加入到3个10 mL比色管中，再在各比色管中分别加入1.0 mL 0.200 0 mg/mL的芦丁标准溶液，摇匀，静置15 min后按“1.2.3”方法测定吸光度，得到回收率的均值为99.58%，RSD=0.78%，说明该方法准确可靠，可用于黄花草总黄酮得率的测定。

2.4 黄花草总黄酮的抗氧化性

2.4.1 黄花草总黄酮对·OH的清除能力 由图6可知，随着浓度增加，黄花草总黄酮和VC对·OH的清除率均增大。当黄花草总黄酮的浓度为0.25 mg/mL时，对·OH 的清除率达到(52.48±0.88)%，说明黄花草总黄酮对·OH具有一定清除能力，但作用效果弱于VC。

图6 不同质量浓度样品对·OH的清除效果

2.4.2 黄花草总黄酮对DPPH·的清除能力 从图7可以看出，在浓度为0.05～0.25 mg/mL时，黄花草总黄酮和VC对DPPH·均具有较强的清除能力。当浓度为0.05 mg/mL 时，VC对DPPH·的清除率为(95.25±0.43)%，继续增加浓度，清除率无明显变化。黄花草总黄酮对DPPH·的清除率随着浓度的增大而增大，当其浓度为0.25 mg/mL时，对DPPH·的清除率达到(95.58±0.28)%，清除能力接近VC，说明黄花草总黄酮对DPPH·具有很好的清除效果。

图7 不同质量浓度样品对DPPH·的清除效果

2.4.3 黄花草总黄酮对亚硝酸盐的清除能力 从图8可以看出，当浓度为0.05，0.10 mg/mL时，黄花草总黄酮对亚硝酸盐的清除能力强于VC，继续增大浓度，黄花草总黄酮对亚硝酸盐的清除能力弱于VC。当浓度为0.25 mg/mL 时，黄花草总黄酮和VC对亚硝酸盐的清除率分别为(57.27±0.15)%，(85.59±0.21)%，说明黄花草总黄酮对亚硝酸盐具有一定的清除能力，但弱于VC。

图8 不同质量浓度样品对亚硝酸盐的清除效果

3 结论

试验表明，黄花草总黄酮的最佳提取工艺为料液比1∶15 (g/mL)，乙醇浓度50%，提取功率40 W，超声时间50 min，提取温度50 ℃，此条件下得到黄花草总黄酮得率为(2.711±0.002)%。在考察的浓度范围内，黄花草的抗氧化能力随总黄酮浓度增加而增强，当总黄酮浓度为0.25 mg/mL时，对·OH、DPPH·和亚硝酸盐的清除率分别为(52.48±0.88)%，(95.58±0.28)%，(57.27±0.15)%。黄花草中的总黄酮是一种活性较好的抗氧化剂。试验仅研究了黄花草总黄酮的超声辅助提取工艺及抗氧化活性，采用其他提取技术总黄酮得率如何，黄花草中总黄酮的开发利用还有待进一步研究。