茶黄素双没食子酸酯的生物活性及其作用机制

雷时成 孙大利 王亚洁 周 艳 张清海

(1. 贵州医科大学公共卫生学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；3. 贵州医科大学食品科学学院，贵州 贵阳 550025)

茶叶是世界上最受欢迎的饮料之一，而红茶又约占整个茶饮料行业消费总量的78%[1-2]。茶黄素类化合物是红茶加工过程中茶儿茶素和没食子酸等酚类物质经多酚氧化酶催化氧化形成的一类二聚体，约占红茶水提物干重的2%～6%。茶黄素的苯骈卓酚酮结构对红茶独特口感和品质起着重要作用。茶黄素(theaflavin，TF1)、茶黄素-3-没食子酸酯(theaflavin-3-gallate，TF2A)、茶黄素-3’-没食子酸酯(theaflavin-3’-gallate，TF2B)和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(theaflavin-3,3’-digallate，TFDG)是红茶最主要的茶黄素类化合物。TFDG(图1)是茶黄素类物质中最有效的抗氧化剂和生物活性化合物[3-4]，近年来国内外学者对TFDG进行了深入研究，动物和体外模型试验[5-7]显示TFDG具有抗氧化、抗癌、抗炎症、抗病毒、抗肥胖以及预防心血管疾病等多种生物活性，但专门针对TFDG生物活性的研究综述还未见报道。文章对近年来国内外关于TFDG的生物活性及其主要作用机制研究进展进行综述，以期为中国红茶资源的深层次研究和健康功能性产品开发提供理论依据。

1 抗氧化作用

TFDG可通过抑制自由基的产生、直接清除自由基以及激活机体抗氧化体系等不同途径和机制发挥抗氧化作用。

图1 茶黄素双没食子酸酯的化学结构

1.1 抑制自由基产生

Su等[8]比较了茶黄素类化合物在菜籽油中的抗氧化能力，发现TFDG的抗脂质氧化能力最强。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键氧化还原酶，抑制酪氨酸酶活性是当今开发美白护肤产品的主要依据之一[9]。周盈利等[10]比较了5种茶黄素单体和EGCG对酪氨酸酶的抑制活性，结果显示TF1、TF2A、TF2B和TFDG对酪氨酸酶都有较强的抑制作用，而且发现茶黄素分子结构C-3’位的没食子酰基取代对提高抑制活性有重要作用。Leung等[11-12]构建人体低密度脂蛋白(LDL)氧化模型发现，茶黄素和儿茶素均具有抑制Cu2+介导的LDL氧化作用。通过检测氧化产物硫巴比妥酸和共轭二烯的生成评价抗氧化性强弱顺序为：TFDG>ECG>EGCG=TF2B=TF2A>TF1=EC>EGC，表明TFDG具有较强的电子转移能力，将Cu2+还原成Cu+。

1.2 直接清除自由基

Sang等[13-14]应用体外模型试验比较了4种主要茶黄素单体和EGCG的抗氧化活性和预防羟基自由基诱导的DNA损伤效果，结果发现TFDG在清除H2O2和羟基自由基方面活性最高，而TF2A和TF2B次之，TF1的活性最低，说明没食子酰基在清除H2O2和羟基自由基活性方面具有决定作用，而且根据反应产物结构推测A环可能是H2O2氧化体系中形成反应产物的起始位点。

1.3 激活机体抗氧化体系

Yang等[15]研究发现人胚肺成纤维细胞HPF-1细胞经TFDG预处理2 h后可显著提高细胞对自由基损伤的抵抗能力。小鼠腹膜巨噬细胞或人脐静脉血管内皮细胞经TFDG预处理后，可以有效减少细胞内Ox-LDL的产生，而且TFDG预处理还可以显著减少巨噬细胞超氧化物的产生以及螯合铁离子[16]。

2 抗癌作用

近年来，癌症已成为危害人类生命健康的主要疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势，癌症治疗一直是医药研究领域亟待解决的难题[17]。TFDG在直接抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、使癌细胞发生周期阻滞、氧化应激、抑制血管发生、联合用药以及代谢产物抗癌等方面，通过多层次多靶点发挥抗癌作用。Wang等[18-19]研究发现TFDG对胃癌SGC-7901细胞株、肺癌A549细胞株、食道癌细胞株KYSE 150和KYSE 510等多种癌细胞增殖均具有显著的抑制作用。雄激素是前列腺癌发生的起始要素，TFDG通过抑制雄激素受体的表达，阻止雄激素与其受体结合，实现抑制前列腺癌细胞系LNCaP生长[20]。芳香化酶可催化雄烯二酮转化为雌酮，通过调控雌激素的可用性促进激素依赖性乳腺癌的生长。TFDG在体外试验[21]中均具有较强的抑制芳香化酶活性，同时TFDG还可作为一种HER2/neu酪氨酸磷酸酶抑制剂抑制雌激素非依赖性乳腺癌细胞系MCF-7的增殖。Schuck等[22]应用体外细胞试验研究发现，TFDG通过诱导氧化应激作用促使人口腔鳞癌细胞系HSC-2细胞凋亡。TFDG也可通过抑制血管发生具有抗癌作用，人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株经TFDG预处理后，通过抑制癌细胞表皮生长因子(EGF)受体和血小板衍生因子(PDGF)受体自体磷酸化，阻断EGF与受体结合的作用，抑制促有丝分裂信号的传导[23]。Gao等[24]也研究发现，在人脐静脉内皮细胞模型和鸡胚绒毛尿囊膜模型中TFDG通过下调HIF-1α和VEGF因子抑制人卵巢癌细胞系OVCAR-3诱导的血管生成。抑制DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)是治疗癌症的一种有效方法。体外试验[25]显示TFDG具有有效的DNMT3a抑制作用并呈现合理的药代动力学特征可用于防治前列腺癌。对于结肠癌细胞系HCT-116生长的抑制作用，TFDG可将癌细胞周期阻滞在G1期。同时，TFDG还可以通过降低癌细胞促癌蛋白因子Bcl-xL的表达和增加抑癌蛋白因子Bax的表达来诱导癌细胞凋亡[26]。TFDG还可与其他药物联用增强抗癌效果，对于人肺癌细胞系SPC-A-1和食道癌细胞系Eca-109，VC和TFDG的协同作用可增强对两种癌细胞的抑制效果，该作用涉及半胱天冬酶-3和-9的活化。TFDG和VC分别激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，并且两种化合物在不同的癌细胞中激活不同的MAPK亚族[27]。TFDG和VC的协同抑制作用使肺癌细胞SPC-A-1的细胞周期停滞在G0/G1期[28]。Pan等[29-30]应用TFDG和顺铂联合作用卵巢癌细胞，结果显示对A2780/CP70和OVCAR3细胞株的协同细胞毒性，诱导卵巢癌细胞凋亡和G1/S期阻滞，下调癌细胞中丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)磷酸化。经TFDG处理可以增加细胞内铂(Pt)和DNA-Pt加合物的积累以及增强顺铂诱导的细胞DNA损伤。TFDG通过降低谷胱甘肽(GSH)水平和上调铜离子转运蛋白1(CTR1)的蛋白质水平来增加两种卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。对于顺铂耐药的卵巢癌细胞株A2780/CP70，TFDG通过内外源性凋亡途径诱导细胞凋亡，由细胞周期蛋白B1引起G2细胞周期停滞。p53蛋白在TFDG诱导的细胞凋亡和G2细胞周期停滞中发挥重要作用。TFDG可能通过Akt/MDM2途径上调p53蛋白表达[31]。也有研究[32]发现TFDG可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌细胞株A2780/CP70和OVCAR-3肿瘤干细胞的增殖。尽管大量的研究证实TFDG对癌细胞具有抑制增殖和促凋亡的作用。然而，TFDG在一般的培养条件下不稳定。Ding等[33]将TFDG经不同的前处理后作用于结肠癌细胞株HCT116发现，O-TFDG(TFDG在37 ℃细胞培养基中预处理3 h后再加入96孔板中)比TFDG显示出更有效的抑制HCT116结肠癌细胞增殖的活性，O-TFDG主要通过增加p53、p21和活化型半胱天冬酶-3的表达并将细胞周期阻滞于G2期，推测TFDG的降解产物对抑制癌细胞增殖起着关键作用。

3 抗炎作用

TFDG可通过多途径、多环节发挥抗炎作用，作用机制包括抗氧化以及对炎症因子和炎症信号通路的影响，而其独特的苯骈卓酚酮结构以及含有的没食子酰基可能是发挥抗炎症作用的必需基团[19]。人类慢性疾病如风湿性关节炎、炎症性肠道疾病以及过敏反应等多是由慢性炎症引起[34-35]。脂肪组织中肥厚脂肪细胞和巨噬细胞的旁分泌环路介导与肥胖疾病发展的慢性炎症密切相关。Ko等[36]应用小鼠脂肪细胞3T3-L1和巨噬细胞Raw264.7 transwell共培养模型发现，TFDG通过AMPK依赖性信号通路阻断脂肪细胞的炎症发生，并促使炎症M1型巨噬细胞向炎症较轻的M2型巨噬细胞转化来预防代谢炎症及肥胖并发症的发生。TFDG具有显著抑制炎症巨噬细胞系RAW264.7中IκB激酶(IKK)活性，并阻止细胞中IκBα和IκBβ的降解。TFDG对IKK活性的抑制可通过直接作用于IKKs或信号转导途径中上游事件而发生。TFDG也可阻断胞浆部分IκB的磷酸化，抑制NF-κB活性，并抑制诱导型iNOS水平的增加[37-38]。对于三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠产生结肠炎模型，TFDG同样通过抑制细胞中IκBα的降解而下调NF-κB的活化发挥抗炎作用[39]。Wu等[40]应用体内外试验发现，TFDG可抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞c-Jun N端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化，也可抑制佛波醇酯介导的U937和RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。同时，TFDG具有缓解治疗脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的严重程度。周盈等[41]研究发现IL-1β体外诱导大鼠软骨细胞炎性损伤试验中，TFDG预干扰能明显改善骨关节炎软骨细胞形态；上调软骨细胞分子标记物Col II mRNA表达和下调炎症因子IL-1β、IL-6 mRNA的表达；降低炎症诱导酶环氧化酶COX-2蛋白表达量，从而减少炎性介质产物的合成，达到抗炎作用。小鼠体内试验[42]也证实TFDG可通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活缓解类风湿性关节炎。牙周病是一种慢性感染性疾病，一系列的免疫炎症反应参与了疾病的病理过程。Hosokawa等[43]应用人牙龈成纤维细胞(HGFs)模型研究发现，TFDG通过阻止c-氨基末端激酶(JNK)、蛋白激酶B(Akt)(Ser473)的磷酸化，来抑制抑瘤素M(OSM)介导HGFs中CXC趋化因子配体10(CXCL10)的产生发挥抗炎作用。

4 抗病毒作用

近年来，大量研究[7]表明TFDG具有抗病毒作用，包括单纯疱疹病毒、艾滋病病毒、SARS病毒和丙型肝炎病毒。其作用机制可能为TFDG能够直接作用于病毒的特定靶点，抑制病毒的复制和进入宿主细胞。Oliveira等[44]构建非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和人肺癌细胞株A549模型发现，TFDG通过阻碍病毒结合或穿透细胞具有抗单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染作用。TFDG在阴道pH条件下具有稳定性，表明其可作为针对抗单纯疱疹病毒感染的潜在药物。然而，病毒一旦侵入到细胞内，TFDG就失去抗病毒作用。Isaacs等[45]研究发现，TFDG与乳酸的联合应用在无细胞毒的浓度下可以有效抑制HSV病毒的复制。在女性生殖道pH 4.5～5.7条件下，TFDG与乳酸联合应用可完全灭活6种HSV-2临床分离株和2种HSV-1临床分离株，但作用于另外4种HSV-1临床分离株需要达到相同的灭活效果时，TFDG的浓度则需要提高2～5倍。将TFDG和乳酸混合物在37 ℃条件下存储1个月，在pH 4.5～5.7的范围内仍可保持抗病毒活性。艾滋病是一种免疫缺陷病，由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。目前市场上应用的抗HIV药物只有病毒进入宿主细胞后才能发挥作用。TFDG则可通过阻断HIV-1包膜糖蛋白跨膜亚基gp41介导的膜融合阻止HIV-1进入靶细胞。其抗病毒作用机制为TFDG结合到病毒跨膜亚基gp41的N-末端高度保守的疏水区域上阻碍gp41六螺旋束的形成，而且含有没食子酰基的儿茶素更具有潜在的预防和治疗HIV病毒感染的作用[46-47]。严重急性呼吸综合征(SARS)是一种由SARS冠状病毒引起的急性呼吸道传染病。3C样蛋白酶被认为是SARS冠状病毒感染宿主细胞复制过程的关键酶。Chen等[48]研究发现，在筛选的720种化合物中TFDG对3C样蛋白酶的抑制作用最显著，推测TFDG分子结构中连接在C-3’位置的没食子酰基可能是与3C样蛋白酶活性部位相互作用的重要基团。对于丙型肝炎病毒(HCV)，在感染的早期阶段TFDG以剂量依赖性方式抑制HCV感染，其作用机理是直接作用于病毒颗粒并能抑制细胞间的扩散。而且，TFDG与最广泛使用的抗HCV药联合应用可起到增效剂的作用[49]。

5 防治代谢综合征

肥胖是代谢综合征发生的主要诱因，因此控制体重有助于预防代谢综合征的发生[50-51]。Ko等[52]研究发现TFDG可通过激活AMPK途径减少脂肪细胞中三酰甘油的积累。此外，通过AMPK-FoxO3A-MnSOD途径TFDG可以减少ROS的产生，并减弱成熟脂肪细胞中胰岛素诱导的肥胖。纤溶酶原激活因子抑制剂-1(PAI-1)的失活能够缓解动脉粥样硬化和减轻肥胖患者的体重。体外细胞试验[53-54]研究发现，TFDG对PAI-1具有强有力的抑制作用并呈浓度依赖性。胰脂肪酶在脂肪代谢中起着关键作用，也是抗肥胖的有效目标。TFDG具有显著的抑制脂肪酶活性且表现出对底物浓度的混合抑制作用，能减少三酰甘油的吸收，抑制餐后高三酰甘油血症。计算机辅助分子对接技术显示TFDG与胰脂肪酶中氨基酸残基Asn263和Asp206结合，形成与活性位点相邻的口袋，扰乱关键催化残基His264的质子化[55-56]。

在中国，心血管疾病的发病人数呈逐年增加趋势，死亡率居各种疾病的首位[57]。Lorenz等[58]构建主动脉内皮细胞模型评价了TFDG对预防心血管疾病的作用。结果表明，TFDG具有显著的增加内皮细胞NO合酶(eNOS)活性以及促进血管舒张能力。新生大鼠心肌细胞经TFDG预处理1 h后再用H2O2诱导氧化应激30 min，通过检测24 h后乳酸脱氢酶的释放量，表明TFDG能有效保护心肌细胞，但TFDG预处理心肌细胞时间越长保护效果越差。用二氯荧光素加载心肌细胞，在诱导氧化应激30 min后用TFDG处理，活性氧的细胞内水平显著降低[59]。高血压患者与同型半胱氨酸(Hcy)水平升高有关。Hcy可诱导血管内皮细胞内质网应激。Cheang等[60]构建Hcy对体外培养大鼠主动脉内皮细胞损伤模型发现，细胞预先与TFDG孵育，可降低ER应激相关蛋白ATF3，磷酸化的eIF2α(Ser52)和裂解的ATF6的表达，逆转ROS产生，明显改善Hcy诱导的血管内皮细胞舒张功能的损害。2型糖尿病是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病，在长期高血糖水平下可引起各种并发症，所以控制餐后血糖水平是预防高血糖的有效方法[61-62]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是调节食物来源血糖的关键酶，其抑制剂是一类调控餐后血糖水平作用独特的口服降糖药物。Matsui等[63]研究发现TFDG优先抑制麦芽糖酶而不是蔗糖酶。Miao等[64]应用体外试验和计算机辅助分子对接技术研究发现，4种茶黄素单体中TFDG对α-淀粉酶抑制活性最强。茶黄素的抑制活性取决于其分子结构上的羟基和没食子酰基通过氢键和π—π键与α-淀粉酶的活性中心氨基酸残基相互作用。与非酯型茶黄素相比，酯型茶黄素与α-淀粉酶具有较强的结合力。

6 其他活性作用

除具有上述各种生物活性外，TFDG还具有抗菌、抗过敏、促进骨细胞生长以及防治阿尔茨海默病等多种活性。在抑制牙周病原细菌试验[65]中发现，TFDG可增强甲硝唑和四环素对牙龈卟啉单胞菌的抗菌作用，也具有诱导口腔上皮细胞增加3种抗菌肽hBD-1、hBD-2和hBD-4的分泌作用。产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体，研究[66]发现高浓度的TFDG对产气荚膜梭菌具有强效的细胞损伤作用。枯草芽孢杆菌形成休眠和抗应激孢子，是食品工业面临的一个日益严重的问题。Pandey等[67]研究发现，TFDG对枯草芽孢杆菌孢子发芽和细胞倍增时间具有一定的抑制作用。对于TFDG的抗过敏作用，Yoshino等[68]研究了TFDG对恶唑酮诱导的雄性ICR小鼠IV型过敏的预防作用。0.2 mg/耳TFDG经皮给药显示出对小鼠IV型过敏症的显著预防作用。口服TFDG剂量为50 mg/kg显示出对小鼠IV型过敏症的预防效果，并可防止IV型过敏小鼠血清和/或耳中IL-12、干扰素-γ和TNF-α等促炎细胞因子的表达。而且，口服TFDG可提高具有过敏症状小鼠的血清抗氧化活性。对于预防骨质疏松症，Hu等[69]发现TFDG通过抑制ERK信号通路及其下游因子NFATc1和c-FOS，来抑制破骨细胞生成和破骨相关基因的表达，实现小鼠颅骨模型钛颗粒诱导的骨溶解保护作用。此外，TFDG还可通过抑制DNA甲基化消除骨质疏松症中骨质流失[70]。有研究[71]认为脑内β-淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)大量积累是造成阿尔茨海默症的罪魁祸首。张静等[72]通过模拟生理条件体外试验发现，TFDG能够抑制β-淀粉样蛋白1-42(Aβ42)的聚集纤维化和因Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞活力下降及氧化损伤，对阿尔茨海默病具有一定的防治作用。蛋白质老年色素荧光物质是一种生物体衰老的标志物，随着年龄的增长而增加。TFDG不仅可以抑制羰基应激产生的蛋白质老年色素荧光物质，而且能够抑制蛋白质的聚集化产生的β-sheet结构，具有潜在的延缓衰老和预防阿尔茨海默病等神经退行性疾病的作用[73]。糖尿病白内障是全球眼病致盲的主要原因。牛丽等[74]构建高浓度葡萄糖诱导人晶状体上皮细胞(HLECs)损伤模型，经TFDG干预后，细胞内iNOS的活性降低，减少了NO的合成，从而提高模型细胞的存活率。

7 展望

综上所述，TFDG具有多种生物学功能和诸多分子靶点。然而，在人体试验研究中受试者口服高浓度的茶黄素混合物(700 mg)后，人体血液中TF1浓度在2 h后达到峰值仅为1.0 mg/L，尿液中的TF1浓度在2 h后的峰值也仅为4.2 mg/L，同时均未检测到TF2A、TF2B和TFDG的存在[75]。这些结果表明茶黄素只有很少部分以原始结构被人体吸收，大多数茶黄素并未被人体吸收或者在消化环境中被转换成其他活性成分。人体胃肠道消化环境复杂，多酚类天然活性成分进入人体胃肠道消化环境后不可避免的会发生结构变化，尤其在小肠弱碱性的环境中极易发生降解反应[76-77]。因此，研究TFDG胃肠消化代谢物变化及吸收机制对明确其药理作用具有重要的研究意义。同时，肠道菌群与机体健康密切相关，并且它们具有巨大的代谢潜能，能将膳食多酚转化为微生物代谢产物，多酚也可以影响肠道微生物的菌群结构和代谢通路[78-81]。TFDG通过肠道菌群作用生成的代谢衍生物，可能是真正在体内发挥生理功能的活性物质。研究TFDG进入大肠中与肠道微生态的互作效应机制，对深入解析TFDG在体内发挥生物活性的作用机理，也具有重要学术意义。此外，针对TFDG主要在体外试验中显示出极佳的生物活性，但生物利用度差的缺点。因此，通过分子结构修饰或者设计制备药物输送载体来提高其生物利用度和增强其生物活性[82]，对于TFDG的实际应用和产品开发也具有重要研究价值。