不同炒制工艺对紫苏子化学成分的影响*

★ 罗宇琴 杨文惠 潘礼业 魏梅 陈向东 马瑞瑞 吴文平 霍文杰 李国卫* 孙冬梅（广东一方制药有限公司 广东 佛山 528244）

紫苏子为唇形科植物紫苏Perillafrutescens（L.）Britt. 的干燥成熟果实，秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干，紫苏资源在我国分布范围较广，分布于广东、广西、湖北、云南、贵州、四川、台湾、浙江、安徽、福建等省区［1］，紫苏属植物喜温、短日照，适应能力强，目前在我国的东北、西北、东南及西南地区21个省均有种植。其性温，味辛，具有降气化痰，止咳平喘，润肠通便的功能，临床主要用于治疗痰壅气逆，咳嗽气喘，肠燥便秘等［2］。

目前对紫苏子的炒制工艺多为清炒，如《中国药典》2015年版［2］紫苏子饮片项下为“取净紫苏子，照清炒法，炒至有爆声”，《天津市中药饮片炮制规范》［3］为“将锅加热，取净苏子置锅内，炒至表面顔色加深，嗅有香气逸出时，取出，放凉”。《湖南省中药饮片炮制规范》［4］为“取净苏子，用文火炒至有爆声，取出，放凉”。《上海市中药饮片炮制规范》［5］为“取生紫苏子，照清炒法，炒至有爆声”，但上述炒制方法均为经验性的术语难以进行量化控制，均未对炒制过程进行规范化说明。同时，紫苏子生品善于润燥滑肠，而炒后善于温肺降气的药效作用增强，未能说明紫苏子炒制过程中到底是哪些化学成分发生了变化，是否产生了新的化学成分，这些产生的化学变化与炒制后辛散之性缓和及温肺降气作用增强之间有何联系［6］。因此需要进一步针对种子类中药炒制过程成分变化规律进行分析和研究［7］。本研究拟通过正交试验，优选紫苏子饮片炒制工艺参数，同时说明不同炒制工艺对紫苏子化学成分的影响，为炒制过程的规范化及炒紫苏子的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 实验仪器 Waters高效液相色谱仪（Waters e2695），Waters超高效液相色谱仪（H-Class），Agilent SB C18色 谱 柱（4.6mm×150mm，5μm），Agilent SB C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；万分之一天平（梅特勒-托利多公司，ME204E）；百万分之一天平（梅特勒-托利多公司，XP26）；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司，HWS-28）；数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；电陶炉（江苏九阳，H22-X3）；超纯水系统（默克股份有限公司，Milli-Q Direct）。

1.2 实验材料 咖啡酸（批号：110885-201703，纯度：99.7%）、迷迭香酸（批号：110871-201706，纯度：90.5%）、木犀草素（批号：111520-201605，纯度：99.6%）对照品购自中国食品药品检定研究院；水为超纯水，其他试剂为分析纯。本实验所用的紫苏子药材由广东一方制药有限公司提供，采自甘肃省庆阳宁县春荣镇，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为Perillafrutescens（L.）Britt.的干燥成熟果实，样品保存于质量中心。

2 方法

2.1 紫苏子的炒制方法优化 本试验在传统炒制工艺基础上，取净选后的紫苏子100g，平行9份，采用正交设计来对电炒锅功率（A）、炒制时间（B）、翻动频率（C）进行优选，每个因素取3个水平，见表1。分别以迷迭香酸含量及基于主成分分析的4个特征峰峰面积/称样量标准化值为指标，进行炒制工艺评价。

表1 紫苏子炒制工艺参数设计

2.2 迷迭香酸含量测定方法 参照中国药典2015年版紫苏子项下含量测定方法。

2.3 紫苏子特征图谱方法

2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.8μm）；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，按梯度洗脱（0～6min，10% → 18%A；6～15min，18% → 50%A）；流速为0.3mL/min；检测波长为330nm；柱温为30℃；进样量为2μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素对照品适量，加甲醇配制成每mL各含咖啡酸3μg、迷迭香酸 40μg、木犀草素 5μg的混合对照品溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取紫苏子饮片（过二号筛）适量，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 取紫苏子饮片（过二号筛）适量，取约0.5g，精密称定，按照“2.3.3”项下制备供试品溶液，分别取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液，各进样2μL，结果见图1。

图1 紫苏子特征图谱专属性考察

通过专属性实验结果表明，该分析方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂的干扰。

2.4.2 精密度考察 取紫苏子药材按照“2.3.3”项下制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件重复进样6次，进样体积2μL。以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD＜1%，该仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性考察 取紫苏子药材按照“2.3.3”项下制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件，分别在0，1，2，4，8，12小时进样，进样体积2μL。以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果12小时内各色谱峰相对保留时间的RSD＜1%，相对峰面积的RSD＜5%，说明该供试品溶液在12小时内基本稳定。

2.4.4 重复性考察 取同一批紫苏子约0.5g，精密称定，平行6份，按按照“2.3.3”项下制备供试品溶液，按“2.3.1”项下规定的色谱条件，分别进样2μL。以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果各色谱峰相对保留时间＜1%，相对峰面积的RSD＜5%，说明该方法重复性较好。

2.5 样品测定 基于已建立的特征图谱方法对紫苏子不同炒制品进行测定，以迷迭香酸峰为参照峰，分别计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积。

3 结果与分析

3.1 迷迭香酸含量测定结果 参照中国药典2015年版紫苏子项下含量测定方法，对不同炒制工艺紫苏子水分及迷迭香酸含量测定结果见表2。结果表明，在该炒制工艺下，紫苏子炒制品均符合中国药典2015版炒紫苏子项下含量限度（以迷迭香酸计，不得低于0.20%）。但以迷迭香酸作为单指标评价紫苏子炒制工艺缺乏一定合理性。

表2 不同炒制工艺迷迭香酸含量测定结果 %

3.2 特征图谱测定结果 特征图谱测定结果表明，以迷迭香酸为S峰，分别计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果见表3～4，同一批次紫苏子饮片不同试验号样品特征图谱的相对保留时间RSD值在0.02%～0.74%，偏差较小，相对峰面积RSD值在4.68%～128.07%，波动较大，说明不同炒制工艺间样品特征图谱差异较大。9批样品叠加图见图2。

表3 紫苏子不同炒制品特征图谱结果（相对保留时间）

表4 紫苏子不同炒制品特征图谱结果（相对峰面积）

图2 炒紫苏子特征图谱叠加图

3.3 紫苏子炒制工艺参数优化

3.3.1 主成分分析 不同炒制工艺中经特征图谱结果发现明显产生特征峰X1、X2，说明经炒制后有明显成分变化，为进一步说明炒制参数的合理性以适应工业化生产，因此需进一步对炒制工艺参数进行优化。本研究以特征峰峰面积/称样量为指标对不同炒制品进行研究，结果见表5。

应用SPSS20.0软件对紫苏子不同炒制品的特征峰峰面积进行主成分分析，选择特征值＞1的指标为主成分，结果提取出两个主成分，累积贡献率达到94.56%。结果见表6。因此选择提取的两个主成分进行分析，从旋转成分矩阵来看，第一主成分主要反映了来自原始色谱峰1、2（咖啡酸）、3、4、5、6（迷迭香酸）的信息，第二主成分主要反映了来自原始色谱峰X1、X2、7的信息，因此根据各特征峰对主成分的影响系数，其中峰5、峰6（迷迭香酸）对主成分1影响较大，峰7（木犀草素）、X1、X2对主成分2影响较大，结果见表7。

表5 炒紫苏子特征图谱峰面积/称样量值

表6 解释的总方差

表7 旋转成份矩阵a

3.3.2 方差分析 基于主成分分析结果，选已知峰迷迭香酸及木犀草素为指标考察紫苏子的炒制工艺，以迷迭香酸及木犀草素特征峰峰面积/称样量，按公式Xij’=Xij/Xijmax进行标准化处理，Xij’为样品中第i类成分j的标准化值，Xij为样品中第i类成分j的值，Xijmax为样品中第i类成分j的最大值。经文献研究，紫苏子经炒制后，黄酮类成分含量较生品增加，而迷迭香酸因受热易分解，因此按照炒制工艺选择中的主次地位，赋予不同的加权系数，以标准化后的值Xij’加权后求和，及综合评价指标Y=迷迭香酸×12%+木犀草素×88%），结果见表8。进一步将Y值代入正交试验表，正交试验结果见表9，得到方差分析结果见表10。

直观分析结果表明，三因素对结果影响的大小顺序为：电炒锅功率＞翻动频率＞炒制时间。方差分析结果表明，影响因素A的水平变化对于炒制工艺实验结果有显著影响，考虑到因素B（炒制时间）在水平1和水平3差异不大，因此综合得到最佳炒制工艺为A3B1C2，即控制锅温为190℃，电炒锅功率为1000W，炒制时间4min，翻炒频率为60次/min。

表8 炒紫苏子标准化指标处理结果

表9 炒紫苏子正交试验结果表

表10 炒紫苏子方差分析表

3.4 紫苏子炒制工艺验证 另平行称取三批紫苏子，按照上述炒制工艺，进行炒制，得到三批样品工艺验证，含量测定结果见表11，特征图谱相对保留时间及相对峰面积结果见表12～13。结果表明，三批样品工艺验证迷迭香酸含量测定均值为0.33%，RSD值为1.11%，说明，三批样品含量无明显差异，三批样品相对保留时间RSD值在0.00%～1.30%，说明各特征峰相对保留时间偏差较小，但相对峰面积RSD值波动较大，可能与峰面积较小有关。整体来看，三批样品炒制工艺的重现性较好。

表11 炒紫苏子工艺验证含量测定结果 %

表12 炒紫苏子工艺验证特征图谱结果（相对保留时间）

表13 炒紫苏子工艺验证特征图谱结果（相对峰面积）

4 讨论

（1）考察影响紫苏子特征图谱的前处理方式，分别以甲醇、乙醇、80%甲醇、50%甲醇、稀乙醇作为提取溶剂时，其中50%甲醇及稀乙醇对木犀草素提取效率不高，整体以80%甲醇提取效率较高；分别考察超声提取及加热回流，发现两者的提取效率相当，为操作的简便性，选超声提取方式；分别对超声时间进行分析，超声15、30、45min时，对色谱峰的提取效率相当，为保证提取充分，选择超声时间为30min。

（2）紫苏子经炒制后迷迭香酸含量明显降低，结合特征图谱数据来看，从试验号1～试验号9，峰1、峰2（咖啡酸）、峰3的相对峰面积均呈现明显下降趋势，峰4、峰5的相对峰面积变化较为平缓，而峰X1、X2的相对峰面积呈现明显梯度性上升趋势，推测，两者的峰面积变化与温度有关，存在一个温度拐点。同时，本实验通过红外测温枪对炒制过程中的温度进行测定，从试验号1～9物料的出锅温度来看，其中试验号1的出锅温度为110℃，试验号2～3的出锅温度为125℃～130℃，试验号4～5的出锅温度为140℃～145℃，试验号6的出锅温度为157.2℃，试验号7的出锅温度为170℃，试验号6的出锅温度为185℃，试验号6的出锅温度为200℃，因此推测，该温度拐点可能在165℃～170℃。同时结合特征峰X1的紫外最大吸收分别在248nm与340nm，特征峰X2的最大吸收分别在243nm与344nm，位于黄酮类成分的紫外吸收区，推测可能为黄酮类成分，这可能是由于在炒制过程中该物质化学键发生改变，导致原来没有紫外吸收度物质具有较强的紫外吸收。

（3）基于主成分分析，结合特征图谱方法对紫苏子炒制工艺进行研究，发现，当物料温度为165℃～170℃时，咖啡酸、迷迭香酸等酚酸类成分明显降低，而木犀草素等黄酮类成分增加，与文献报道一致。根据“逢子必炒”的基本原则，经炒制后，紫苏子挥发油含量降低，咖啡酸、迷迭香酸等酚酸类成分明显降低，而木犀草素等黄酮类成分增加，与炒紫苏子燥性减弱而温肺降气作用增强结论一致。但具体成分变化机制有待进一步研究。