HPLC法同时测定芩黄颗粒中黄芩苷和甘草酸的含量

许艺凡，周冰，张聪，姚路路，杨会鲜，周德刚，张晓会

(国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，河南洛阳 471000)

芩黄颗粒是由黄芩、板蓝根、麻黄、山豆根、甘草、桔梗等六味中药组成的中兽药制剂，该方由《伤寒论》“麻杏甘石汤”药味加减而来，目前收载于《兽药质量标准》2017年版。方中黄芩性寒、味苦，有清热燥湿、泻火解毒、凉血除热的作用，可治疗肺热咳嗽、湿热泻痢；甘草性平、味甘，有和中缓急、润肺解毒的功效，可治疗咽喉肿痛、肺痿咳嗽等症。该药在临床上主要用于鸡传染性支气管炎的预防与辅助性治疗[1]。目前，芩黄颗粒质量标准中含量测定项分别对黄芩苷与甘草酸进行测定，也有学者单独研究了芩黄颗粒中甘草酸或黄芩苷的含量测定方法[2-3]，但未见有同时测定黄芩苷与甘草酸含量的相关报道。本研究首次建立了同时测定芩黄颗粒中黄芩苷和甘草酸含量的高效液相色谱方法，该方法简便、准确，可以提高该制剂在实际生产中的检验效率，为该制剂的质量控制提供了参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，配备2489型紫外检测器；AB265-S电子分析天平，METTLER TOLEDO 公司；KQ-500DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料 黄芩苷对照品(批号110715-201720，含量：93.52%，中国食品药品检定研究院)；甘草酸铵对照品(批号110731-201720，含量：94.3%，中国食品药品检定研究院)；芩黄颗粒(洛阳惠中兽药有限公司，批号：20190704、20190705、20190706，规格：500 g /袋)；乙腈、甲醇均为色谱纯，Thermo Fisher Scientific公司；磷酸为分析纯，天津大茂化学试剂厂；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，0.05 %磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长：252 nm；柱温30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取黄芩苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，置于同一量瓶中，用适量甲醇使溶解，再加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照溶液(黄芩苷浓度为0.3092 mg/mL、甘草酸铵浓度为0.0413 mg/mL)(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取处方中去除甘草、黄芩的其他药材，按芩黄颗粒处方比例和工艺制备阴性对照样品，按2.2.2项方法，制备阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图(图1～图3)。结果表明：供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且阴性无干扰，表明本方法专属性良好。

图1 对照品色谱图

图2 供试品色谱图

图3 阴性色谱图

2.4 线性关系考察 分别称取黄芩苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，置于同一量瓶中，用适量甲醇使溶解，再加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品储备液(黄芩苷浓度0.6184 mg/mL、甘草酸铵浓度0.08256 mg/mL)。精密量取混合对照品储备液1、2、3、5、8 mL于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成线性对照溶液。分别精密吸取上述不同浓度的混合对照品溶液和对照品储备液各10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得黄芩苷的回归方程为：Y=12148X+2018.7，R2=0.9999；甘草酸的回归方程为：Y=8209.8X+463.92，R2=0.9999。表明黄芩苷的进样浓度在61.84～618.4 μg/mL的范围内与峰面积线性关系良好；甘草酸的进样浓度在8.256～82.56 μg/ml的范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取2.2.1项的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱图，测得黄芩苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.5%、0.5%(n=6)。表明仪器精密度较好(表2)。

表2 精密度实验

2.6 重复性试验 取批号20190706本品6份，精密称定，按2.2.2项方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，依法测定，结果黄芩苷、甘草酸的平均含量分别为31.2、4.8 mg/g，RSD分别为0.9%、1.0%(n=6)，结果表明，本法具有较好的重复性。

2.7 稳定性试验 取本品，精密称定，按2.2.2项制备供试品溶液，分别于第0、2、4、6、8、10、12 h各精密吸取10 μL注入液相色谱仪，依法测定，结果黄芩苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.3%、0.4%。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定性良好(表3)。

表3 稳定性试验

2.8 加样回收试验 取已知含量样品(批号：20190706)6份，每份约0.25 g，精密称定，按样品含量的100%分别加入黄芩苷和甘草酸对照品储备液，按2.2.2项方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，依法测定，结果黄芩苷、甘草酸的平均加样回收率分别为100.0%、99.2%，RSD分别为1.0 %、0.6%(n=6)，表明方法准确度良好(表4、表5)。

表4 黄芩苷加样回收率

表5 甘草酸加样回收率

2.9 样品测定 取芩黄颗粒3批(批号：20190704、20190705、20190706)，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件分别测定样品中黄芩苷和甘草酸的含量，三批样品的含量测定结果见表6。

表6 样品含量测定结果

3 讨论与结论

3.1 检测波长的选择 分别取黄芩苷与甘草酸对照品溶液，采用紫外光分光光度法进行全波长扫描，结果黄芩苷的最大吸收波长为277 nm、甘草酸的最大吸收波长为252 nm。且两个成分在波长为263 nm处均具有较大的吸收。取供试品溶液，分别在263 nm和252 nm波长下依法测定，结果，在252 nm波长下，甘草酸峰的响应较263 nm下更高，因芩黄颗粒中黄芩苷的含量远高于甘草酸的含量，为使两种成分同时有较好的检出灵敏度，综合考虑，最终选择252 nm作为检测波长(图4)。

图4 紫外全波长扫描图

3.2 流动相的选择 参考《中国兽药典》2015年版二部甘草含量测定项下条件，采用乙腈-0.05%磷酸为流动相进行试验[4]，同时根据文献报道，分别考察了乙腈-0.05%磷酸溶液[5-6]、甲醇-0.1%磷酸溶液[7]、乙腈-0.1%磷酸溶液[8]、甲醇-0.05%磷酸溶液等流动相体系。最终选择乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，主峰的分离效果较好，且基线较平稳，适用于黄芩苷与甘草酸的同时测定。

本文采用高效液相法同时测定了芩黄颗粒中黄芩苷与甘草酸的含量，该方法简便，准确、重复性好，对提高实际生产检验效率及本产品质量控制具有重要意义。