脑心肌炎病毒感染Hela细胞的内吞途径

刘 杨，许淑娟，李琼毅，刘翊忠

(1.西北民族大学 生物医学研究中心，兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，兰州 730030)

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一种重要的人畜共患病病原[1]。该病毒于1945年从美国佛罗里达州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内首次被发现并分离得到，1985 年确诊为猪的致死性病原之一。随后，多个国家报道有该病的爆发和流行。中国于2005年首次从病死仔猪和流产胎儿中分离到EMCV[2]。EMCV感染的临床症状表现为脑炎、心肌炎或心肌周围炎[3]。猪是EMCV的自然宿主[4-5]，感染后可导致猪突然死亡和实质器官的病理性损伤，母猪感染后还可造成繁殖障碍，给世界养猪业造成重大的经济损失[6]。该病目前尚无有效的治疗措施，只能从消灭传染源和切断传播途径方面着手，如扑杀带毒老鼠和带毒猪只等。该病毒可通过多种途径感染动物和人类，但具体的感染机制目前尚不完全清楚[7]。

内吞作用(Endocytosis)是细胞外物质通过质膜的变形运动进入细胞内的过程，也是病毒感染细胞的常见感染途径，在病毒感染宿主细胞的早期发挥作用。有报道称细胞内吞可分为两种类型，一是经典的网格蛋白(Clathrin)参与的内吞，二是非网格蛋白参与的内吞，而非网格蛋白参与的内吞主要包括吞噬作用(Phagocytosis)、小窝蛋白(Caveolin)参与的内吞途径和巨胞饮途径(Macropinocytosis)等[8]。吞噬途径是指高等动物的吞噬细胞摄取和消灭细菌、病毒以及损伤细胞的过程；此途径中，质膜凹陷或形成伪足将入侵物质包裹并摄入细胞，伪足的伸出主要是由肌动蛋白(Actin)参与的[9]。有研究表明，肌动蛋白参与非吞噬细胞的内吞途径，主要在病毒感染细胞的早期发挥核心作用，抑制肌动蛋白可降低多种病毒对细胞的感染，如犬冠状病毒、人冠状病毒和小反刍兽疫病毒等[10-12]。

为了探究EMCV是否通过内吞途径以及通过哪种内吞途径感染细胞，本研究先使用内吞途径抑制剂作用于Hela细胞，然后用EMCV感染处理的细胞。若病毒感染受到抑制，则使用网格蛋白、巨胞饮途径、肌动蛋白的特异性抑制剂作用于Hela细胞，然后检测病毒感染是否受到影响，以此判断EMCV感染Hela细胞具体通过哪种内吞途径发挥作用，以期为临床上防治EMCV及其他经由内吞途径感染宿主细胞的病毒提供思路。再者，随着EMCV感染宿主细胞机制的研究不断深入，有望从抑制内吞途径的主要功能蛋白方面入手，为预防和治疗人与动物的脑心肌炎提供更好的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞及毒株

人宫颈癌细胞(Hela)、仓鼠肾细胞(BHK-21)、脑心肌炎病毒(EMCV)由西北民族大学生物医学研究中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

PCR仪购自Biometra公司；酶标仪购自Thermo Fisher公司；生物荧光倒置显微镜购自Olympns公司；Proliferation细胞活力检测试剂盒购自Gromega公司；PVDF膜购自伯乐生命医学产品公司；ECL显色试剂盒购自PerkinElmer公司；鼠抗VP1 抗体由南京农业大学动物医学院白娟副教授惠赠，兔抗Actin抗体购自Abcam公司，红色荧光标记的山羊抗兔IgG二抗、绿色荧光标记的山羊抗鼠IgG二抗购自Jackson Immuno Research公司；DAPI购自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基购自兰州民海生物工程有限公司；DMSO、Wortmannin购自北京索莱宝科技有限公司；Bafilomycin A1、Chlorpromazine、Pitstop、1,1′-Dithiobis-2-naphthalenol(IPA-3)、Cytochalasin D、Jasplakinolide购自Abcam公司；NH4Cl购自Sigma公司。

1.3 特异性抑制剂浓度筛选

按照抑制剂说明书，用DMSO或PBS将抑制剂配制成含胎牛血清的不同浓度工作液[12]。试验前24 h将处于对数生长期的Hela细胞接种于96孔细胞培养板中，待细胞融合度达80%时分别加入不同浓度的抑制剂工作液，37 ℃恒温培养箱中孵育24 h。24 h后按照Proliferation细胞活力检测试剂盒说明书进行细胞活力检测，试验重复3次，筛选不影响细胞活力的适合抑制剂浓度。

1.4 EMCV感染Hela细胞的内吞途径检测

将对数生长期的Hela细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞融合度达80%～90%时，使用适合浓度的内吞途径特异性抑制剂NH4Cl和Bafilomycin A1工作液作用于Hela细胞1 h，然后用EMCV感染处理的细胞，接毒时病毒与细胞数量之比为0.1∶1(MOI=0.1)，病毒体积=细胞数×0.1/0.7×TCID50[13]，接毒1 h后弃去病毒液，换成含NH4Cl和Bafilomycin A1的细胞维持液，于感染后24 h收集细胞和上清，检测病毒结构蛋白VP1含量、病毒滴度和病毒拷贝数[13]。

1.5 网格蛋白参与的内吞途径检测

参照“1.4”的方法，使用适合浓度的网格蛋白参与的内吞途径特异性抑制剂Chlorpromazine和Pitstop作用于Hela细胞后接毒，于感染后 24 h收集上清，检测病毒滴度和病毒拷贝数。

1.6 巨胞饮途径检测

参照“1.4”的方法，使用适合浓度的巨胞饮途径特异性抑制剂IPA-3和Wortmannin作用于Hela细胞后接毒，于感染后24 h收集上清，检测病毒滴度和病毒拷贝数。

1.7 肌动蛋白参与的内吞途径检测

1.7.1 病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷贝数检测 参照“1.4”的方法，使用适合浓度的肌动蛋白特异性抑制剂Cytochalasin D和Jasplakinolide作用于Hela细胞后接毒，于感染后0 h、6 h、12 h、 18 h、24 h时收集上清，于24 h时收集细胞；取 24 h时收集到的细胞和上清检测病毒结构蛋白VP1含量、病毒滴度和病毒拷贝数，并检测0 h、 6 h、 12 h、18 h、24 h时上清的病毒滴度，绘制病毒生长曲线。

1.7.2 肌动蛋白与EMCV VP1定位检测 试验前24 h，将处于对数生长期的Hela细胞接种于24孔细胞培养板中的爬片上，待细胞融合度达到50%～60%时，接种EMCV，接毒量为0.1 MOI，接毒90 min后弃去病毒液，用1×PBS洗细胞2次，每次5 min，弃去PBS，向每孔加入体积分数为70%的乙醇，置于4 ℃过夜。第二日取出24孔细胞培养板，弃去乙醇，用1×PBS洗2次，弃去PBS，加入鼠源VP1(1∶200稀释)一抗，37 ℃孵育1 h后弃去一抗，用PBS洗细胞4次，每次5 min，弃去PBS；再加入绿色荧光标记的山羊抗鼠IgG二抗(1∶200稀释)，37 ℃孵育1 h，弃去二抗，PBS润洗4次，每次5 min，弃去PBS。然后加入兔源Actin(1∶200稀释)一抗，37 ℃孵育1 h后弃去一抗，PBS洗细胞4次，每次5 min，弃去PBS；再加入红色荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶200稀释)，37 ℃孵育1 h，弃去二抗，PBS润洗4次，每次5 min；然后加入细胞核染料DAPI，孵育10 min，纯水洗细胞10 min；然后取出爬片，倒扣于载玻片上，用荧光封固剂固定，静置10 min后观察。

1.8 肌动蛋白参与吸附和侵入过程的检测

试验开始前24 h将Hela细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞融合度达90%时，使用适合浓度的肌动蛋白特异性抑制剂Cytochalasin D工作液作用于Hela细胞1 h，然后接种EMCV；吸附试验接毒时病毒与细胞数量之比为3∶1(MOI=3)，病毒体积=细胞数× 3 /0.7 × TCID50[13]，侵入试验接毒时病毒与细胞数量之比为2∶1(MOI=2)；然后将吸附试验的接毒细胞培养板置于4 ℃孵育1 h，侵入试验的接毒细胞培养板置于37 ℃孵育1 h；然后取出吸附试验和侵入试验的细胞培养板，弃去其中的病毒液，用无血清DMEM洗细胞 4 次，收集第 4 次洗涤用的无血清DMEM作为背景组病毒；再向其中加入2 mL的无血清DMEM，然后置于-80 ℃超低温冰箱中反复冻融3次，收集孔中的病毒液和细胞碎片，4 ℃、500 r/min离心10 min，吸取上清即为试验组病毒。将收集到的背景组病毒和试验组病毒接种于BHK-21细胞，并分别测定其滴度和拷贝数，试验组与背景组的病毒滴度和病毒拷贝数之差即为最终的病毒滴度和病毒拷贝数。

2 结果与分析

2.1 特异性抑制剂浓度筛选

用不同浓度的抑制剂作用于Hela细胞，24 h后检测细胞活力，未加抑制剂的细胞活力为对照，筛选不影响细胞活力的8种抑制剂的适宜工作浓度。结果如图1所示：内吞途径抑制剂NH4Cl(20 mmol/L和40 mmol/L)、Bafilomycin A1(10 nmol/L和20 nmol/L)，网格蛋白抑制剂Chlorpromazine(5 μmol/L和10 μmol/L)、Pitstop(5 μmol/L和10 μmol/L)，巨胞饮途径抑制剂IPA-3(10 μmol/L和20 μmol/L)、Wortmannin(2.5 μmol/L和5 μmol/L)，肌动蛋白抑制剂Cytochalasin D(5 μmol/L和10 μmol/L)、Jasplakinolide(1 μmol/L和2 μmol/L)。

*.差异显著(P<0.05) Significant diffences(P<0.05); **，*** 差异极显著(P<0.01，P<0.001) Extremely significant diffences(P<0.01,P<0.001);下同 The same below

图1 抑制剂浓度筛选
Fig.1 Screening of inhibitor concentration

2.2 EMCV感染Hela细胞内吞途径检测

用适宜浓度的内吞途径抑制剂NH4Cl和Bafilomycin A1分别作用于Hela细胞后接毒，收集感染后24 h的上清检测病毒滴度和病毒拷贝数，收集细胞检测VP1含量，以未加抑制剂的细胞接毒作为对照组。如图 2所示，经20 mmol/L NH4Cl作用后，VP1相对蛋白含量和病毒滴度下降不显著(P>0.05)，但病毒拷贝数显著降低 (P<0.05)；经40 mmol/L NH4Cl作用后，VP1相对蛋白含量、病毒滴度和病毒拷贝数显著下降(P<0.01，P<0.001)。经10 nmol/L Bafilomycin A1作用后，VP1相对蛋白含量、病毒滴度和病毒拷贝数均显著下降(P<0.05，P<0.01)；经20 nmol/L Bafilomycin A1作用后，VP1相对蛋白含量、病毒滴度和病毒拷贝数下降更加明显(P<0.001)。从总体趋势来看，内吞途径抑制剂NH4Cl和Bafilomycin A1可以抑制EMCV感染Hela细胞。

图2 内吞途径抑制剂作用于Hela细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.2 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with endocytic pathway inhibitor

2.3 EMCV感染Hela细胞网格蛋白依赖型内吞途径检测

使用适合浓度网格蛋白内吞途径抑制剂Chlorpromazine和Pitstop作用于Hela细胞后EMCV攻毒，收集感染后24 h的上清检测病毒滴度和病毒拷贝数。如图3所示，经过Chlorpromazine和Pitstop作用，病毒滴度和病毒拷贝数下降不显著(P>0.05)，提示网格蛋白内吞途径抑制剂Chlorpromazine和Pitstop不影响EMCV感染Hela细胞。

2.4 EMCV感染Hela细胞巨胞饮途径检测

使用适合浓度巨胞饮途径抑制剂IPA-3和Wortmannin作用于Hela细胞后接种EMCV，收集上清检测病毒滴度和病毒拷贝数。如图4所示，经过IPA-3和Wortmannin作用后病毒滴度和病毒拷贝数下降不显著(P>0.05)，提示巨胞饮途径抑制剂IPA-3和Wortmannin不影响EMCV感染Hela细胞。

图3 网格蛋白内吞途径抑制剂作用于Hela细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.3 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Clathrin dependent endocytosis pathway inhibitor

图4 巨胞饮途径抑制剂作用于Hela细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.4 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with macropinocytosis inhibitor

2.5 EMCV感染Hela细胞肌动蛋白依赖型内吞途径检测

2.5.1 肌动蛋白抑制剂作用于Hela细胞对EMCV感染细胞的影响 用适宜浓度Cytochalasin D和Jasplakinolide分别作用于Hela细胞后接毒，收集感染后24 h的上清检测病毒滴度和病毒拷贝数，收集细胞检测VP1相对蛋白含量，未加抑制剂的细胞接毒作为对照组；并检测经10 μmol/L Cytochalasin D作用后0 h、6 h、12 h、 18 h、24 h上清的病毒滴度，绘制病毒增殖曲线。如图5所示，经5 μmol/L Cytochalasin D作用后，VP1相对蛋白含量、病毒滴度和病毒拷贝数下降显著(P<0.05，P<0.01)；经10 μmol/L Cytochalasin D作用后，VP1相对蛋白含量、病毒滴度和病毒拷贝数均下降更明显(P<0.01、P< 0.001)。从病毒增殖曲线也可以看出，在病毒复制增殖过程中，10 μmol/L Cytochalasin D作用后病毒滴度一直低于对照组。如图6所示，经 1 μmol/L Jasplakinolide作用后，VP1相对蛋白含量、病毒滴度和病毒拷贝数无显著下降(P> 0.05)，经2 μmol/L Jasplakinolide作用后病毒滴度和病毒拷贝数下降显著(P<0.05)。从总体趋势可以看出，肌动蛋白抑制剂Cytochalasin D和Jasplakinolide都可以抑制EMCV感染Hela 细胞。

图5 Cytochalasin D作用于Hela细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.5 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Cytochalasin D

2.5.2 肌动蛋白与EMCV VP1蛋白定位检测 用EMCV感染生长状态良好的Hela细胞90 min，再用免疫荧光法对EMCV的结构蛋白VP1和Actin进行染色，然后于镜下观察EMCV VP1和Actin的定位。如图7所示，病毒粒子呈现明显绿色，Actin呈现明显红色，细胞核呈现蓝色；在Merge图中可以看出EMCV和Actin在核周围有明显的橘黄色共定位区域。

2.6 肌动蛋白参与吸附和侵入过程的检测

选取对EMCV复制增殖影响较大的肌动蛋白抑制剂Cytochalasin D，配制成适宜浓度并作用于Hela细胞，然后接种EMCV，检测病毒的吸附和侵入。如图8所示，经Cytochalasin D作用后，病毒滴度和病毒拷贝数无显著变化(P> 0.05)；如图9所示，在侵入试验中，经5 μmol/L Cytochalasin D 作用后，病毒滴度差异不显著，但病毒拷贝数差异显著(P<0.05)，经10 μmol/L Cytochalasin D 作用后，病毒滴度和病毒拷贝数都显著降低(P<0.05，P<0.01)。提示肌动蛋白抑制剂Cytochalasin D对EMCV的吸附过程无影响，但抑制EMCV的侵入。

图6 Jasplakinolide作用于Hela细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.6 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Jasplakinolide

图7 EMCV VP1与Hela细胞Actin的共定位检测Fig.7 Co-localization of EMCV VP1 and Actin

3 讨 论

EMCV是一种重要的人畜共患病病原，不但可感染多种动物和人类，给世界养猪业造成重大损失，而且还威胁人类健康。肌动蛋白在多种病毒感染宿主细胞的内吞途径中发挥重要作用，如犬冠状病毒、人冠状病毒和小反刍兽疫病毒等[10-12]。因此，研究内吞途径在EMCV感染宿主细胞中的作用具有一定的科学价值及意义[14]。

图8 Cytochalasin D作用于Hela细胞对EMCV吸附的影响Fig.8 The impact of EMCV adsorb Hela cells dealt with Cytochalasin D

图9 Cytochalasin D作用于Hela细胞对EMCV侵入的影响Fig.9 The impact of EMCV penetrate Hela cells dealt with Cytochalasin D

内吞途径作为病毒感染宿主细胞的途径，根据主要功能蛋白和进入途径不同可以分为许多不同类型；本研究应用可抑制所有内吞途径的抑制剂以及网格蛋白、大胞饮途径和肌动蛋白的特异性抑制剂来探究EMCV是否依赖于内吞途径感染Hela细胞，以及具体依赖于哪种内吞途径感染Hela细胞。首先笔者筛选了各种抑制剂不影响细胞活力的适合工作浓度，为了使试验数据更具有说服力，也为了减小试验的偶然误差，本研究对每种抑制剂选择两个适宜浓度作用于细胞后接毒。胞内病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷贝数检测结果提示，内吞途径抑制剂NH4Cl和Bafilomycin A1可以抑制EMCV感染细胞，说明EMCV可通过内吞途径进入Hela细胞。然后用不同内吞途径抑制剂来探究EMCV具体通过哪种内吞途径进入Hela细胞。由于网格蛋白依赖型内吞途径是经典的内吞途径，本研究首先检验网格蛋白依赖型内吞途径。试验结果显示，经网格蛋白抑制剂Chlorpromazine和Pitstop作用后EMCV感染未受影响，说明EMCV不通过网格蛋白参与的内吞途径感染Hela细胞。在非网格蛋白参与的内吞途径中，本研究检测了巨胞饮途径，结果同样显示EMCV感染Hela细胞不通过巨胞饮途径。最后，检测肌动蛋白是否发挥作用，胞内病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷贝数检测结果提示经过肌动蛋白抑制剂Cytochalasin D和Jasplakinolide作用后病毒感染受到抑制，最终证明EMCV可通过肌动蛋白参与的内吞途径感染Hela细胞。本研究结果显示，Cytochalasin D对病毒感染的抑制效果强于Jasplakinolide，针对这一现象笔者查阅相关文献，发现Cytochalasin D和Jasplakinolide通过相反的机制抑制肌动蛋白，Cytochalasin D可以抑制肌动蛋白聚合；而Jasplakinolide可以抑制微丝解聚，使大部分肌动蛋白以微丝的形式存在；这两种药物作用机制不同，对肌动蛋白的抑制程度也不同，而且两种抑制剂可以作用于细胞的浓度差异也较大，因此对病毒感染的抑制效果也不同，但试验结果的整体趋势一致，都可抑制EMCV感染Hela细胞[15-16]。在接毒后90 min时，用免疫荧光法对EMCV结构蛋白VP1和肌动蛋白进行染色，镜下可见EMCV和肌动蛋白有明显共定位，同样提示肌动蛋白参与EMCV感染Hela细胞的过程。内吞途径与病毒感染宿主细胞的吸附和侵入过程有关，因此，本研究用肌动蛋白抑制效果较好的特异性抑制剂Cytochalasin D探究肌动蛋白是否在病毒的吸附与侵入过程中发挥作用，结果提示肌动蛋白不参与EMCV的吸附过程，但在侵入过程中发挥作用。综上所述，EMCV可通过肌动蛋白参与的内吞途径感染Hela细胞。

本研究初步探索了内吞途径在EMCV感染宿主细胞中的作用，证明EMCV经肌动蛋白参与的内吞途径感染Hela细胞。这为临床上防治EMCV及其他经由肌动蛋白参与的内吞途径感染宿主细胞的病毒提供一个思路。再者，随着EMCV感染宿主细胞机制的研究不断深入，有望从抑制肌动蛋白方面入手，为预防和治疗人与动物的脑心肌炎提供更好的策略。