深色有隔内生真菌对土壤镉赋存形态和龙葵富集镉的影响

任晋彤，赵金莉

(河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002)

镉是常见的土壤重金属污染元素之一，联合国环境规划署已把镉列为全球性意义危害化学物质之首。据2014年环保部公布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国区域内重金属在土壤中的含量普遍增加，其中镉（Cd）的污染点位超标率达 7.0%［1-2］。镉在土壤中移动性差、不易被微生物降解，常以多种形态赋存，并且其迁移能力、生物有效性和毒性都与形态有密切关系［3］。因此，治理土壤重金属镉污染尤其重要。

Aiking 最先提出了利用微生物功能治理土壤重金属污染的方法［4］。微生物可以通过自身的吸附、代谢作用或转化重金属离子的化学形态以减轻重金属对土壤中植物的危害［5］。但微生物的生长极易受环境条件的影响［6］，直接利用微生物去除土壤重金属的难度大，单一微生物修复技术的应用范围受到限制［7］。深色有隔内生真菌（Dark Septate Endophytic Fungi，DSE）是一类定殖于植物根内的种类组成和生态学功能多样的小型内生真菌，广泛分布于各种受胁迫的生态系统中。张燕［8］、刁玉华［9］、班宜辉［10］等学者从不同胁迫生境分离筛选出多株重金属耐性DSE菌株。研究表明，DSE可以提高宿主植物的抗逆性［11］。目前，有关DSE与植物的共生及重金属抗性机制的研究大多围绕纯培养研究DSE耐性机理及其与植物的共生效应开展［12-14］，而接种DSE进行土培试验研究其对土壤重金属赋存形态的影响尚未见报道。

为此，本研究以分离自白洋淀植物牛鞭草根系的Cd抗性DSE菌株NBC8-7为试材进行土培和盆栽试验，探讨接种DSE对土壤Cd赋存形态和富集植物累积Cd的影响，以期为揭示DSE增强植物重金属抗性机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤采自河北省保定市东郊区农田。土壤基本理化性质见表1。

供试菌株为分离自白洋淀植物牛鞭草根系的Cd抗性DSE菌株NBC8-7（Curvularia clavata）。参照谢玲等［15］的方法制备NBC8-7菌液备用。

供试植物为龙葵（Solanum nigrum），龙葵种子由北京市医科院药用植物研究所提供。

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the tested soils

1.2 试验方法

1.2.1 土壤培养试验 供试土壤高压灭菌后放置2周，向土壤中分别喷洒0、17.8、35.6、53.4 mL 0.01 mol/L的 2(CdCl2)·5(H2O) 溶液（0.45μm滤膜过滤），使Cd2+浓度分别达到0 mg/kg（Cd0）、 5 mg/kg（Cd1）、10 mg/kg（Cd2）、15 mg/kg（Cd3），形成以 Cd 为单一污染源的污染土壤。把同一Cd2+浓度的土壤分为2组，分别装入用高锰酸钾消毒处理过的花盆内（2 kg /盆），采用称重法使含水量保持在田间最大持水量的60%，室温下稳定2周。然后向其中一组土壤内加入100 mL（即50 mL/kg）事先制备好的NBC8-7菌液（DSE+Cd0、DSE+Cd1、DSE+Cd2、DSE+Cd3 4个处理），另一组加入等量灭菌NBC8-7菌液（Cd0、Cd1、Cd2、Cd3 4个处理），充分混合，覆盖保鲜膜（其上用牙签扎数个小孔以通气），在室温条件下进行培养，每处理 3 次重复。隔天用无菌水给土壤补水，使土壤含水量保持在田间最大持水量的 60%，培养4周后采集土壤样品进行测定。

1.2.2 盆栽试验 挑选大小一致饱满的龙葵种子经18 g/L稀HCl溶液室温浸泡24 h［16］，用无菌水冲洗3次，经0.5%NaClO 消毒20 min，无菌水冲洗干净，摆放于灭菌后的滤纸上，25℃暗培养48 h。挑选萌发一致的龙葵种子，播种于上述培养4周后的每盆土壤内，待幼苗出土后，每盆保留3株生长一致的幼苗。温室培养条件：光照16 h（28℃），黑暗8 h（20℃），光照强度为12 000 Lux。培养4周后，收获龙葵地上部和地下部，进行植物和土壤样品的测定。

1.3 Cd含量测定方法

1.3.1 土壤样品的测定 土样样品自然风干，过100目筛。土壤镉赋存形态采用Tessier 五步连续提取法［17］浸提，全镉采用 HF-HNO3-HClO4（1∶4∶1）体系消化；利用型号为TAS-990的原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）测定各形态Cd 含量及 Cd 全量。

1.3.2 植物样品的测定 地下部用去离子水洗净，滤纸吸干表面水分。将地上部和地下部分别装入信封并编号，105℃ 烘箱内杀青 30 min后，65 ℃ 烘干至恒重。称重后，将烘干的植物样品用小型万能粉碎机（QE-100）粉碎保存备用。植物样品采用HNO3-HClO4（4∶1）体系消化，利用原子吸收分光光度法测定Cd 含量。

1.4 DSE在龙葵根内的定殖检测

根样洗净后放入试管，加入10% KOH 溶液浸没根样，于90℃ 水浴锅中解离至根样透明，充分冲洗后，用0.05%酸性品红染色、乳酸甘油脱色后制片［18］，在OLYMPUS-BX53 生物显微镜下测定DSE 定殖率［19］。

1.5 数据处理及分析

采用Excel 2013 软件进行数据处理和图表绘制，利用 SPSS 20.0 版软件进行显著性分析。

富集系数=植物根重金属含量/土壤重金属含量

转运系数=地上部重金属含量/地下部重金属含量［20］。

2 结果与分析

2.1 接种DSE对土壤重金属Cd赋存形态的影响

在不同浓度Cd2+胁迫下，接种DSE后土壤中交换态 Cd 和铁锰氧化态Cd 含量均显著降低，而碳酸盐结合态、有机结合态和残渣态Cd 含量显著增加（P＜0.05）（图1）。

图1 接种DSE对土壤重金属Cd赋存形态含量的影响Fig.1 Effects of DSE on soil Cd fractions

与未接种DSE处理相比，Cd2+浓度为5 、10 、15 mg/kg处理的交换态Cd 含量分别降低了20.74%、15.26%和20.21%，铁锰氧化态 Cd含量分别降低了13.78%、16.05%和16.31%，碳酸盐结合态 Cd 含量分别增加了17.01%、26.83%和30.46%，有机结合态 Cd 含量分别增加了7.83%、15.10%和16.99%，残渣态 Cd 含量分别增加了90.50%、50.32%和44.46%。由此可见，接种DSE能够促进土壤Cd 由活性较强的交换态向稳定的碳酸盐结合态和残渣态转化。

由图2可见，各处理土壤中可交换态、碳酸盐结合态和残渣态重金属Cd比例较高，而有机结合态和铁锰氧化态占比较少。同一Cd2+浓度下，接种DSE与未接种DSE相比，各形态比例有所变化。接种DSE后，可交换态Cd百分比明显降低，与此同时残渣态Cd占比显著増加，而铁锰氧化态、碳酸盐结合态和有机结合态百分比例基本没有变化。

图2 接种DSE对土壤各形态Cd含量所占百分比的影响Fig.2 The effects of DSE on the percentages of each Cd fraction in soil

2.2 DSE菌株NBC8-7在龙葵根系中的定殖

显微观察结果表明，未接种 DSE 处理龙葵根内无DSE定殖，而各接种处理菌株NBC8-7在龙葵根部均有定殖，形成了典型的共生结构（图3），并且随着Cd2+浓度的增加DSE侵染率呈上升趋势，与无Cd2+胁迫处理相比达到显著差异（P＜0.05），而不同浓度Cd2+处理间差异不显著（图4）。

图3 菌株NBC8-7在龙葵根部形成的共生结构Fig.3 Symbiotic structures formed by strain NBC8-7 in roots of solanum nigrum

图4 DSE在龙葵根部的定殖率Fig.4 The colonization rate of DSE in roots of Solanum nigrum

2.3 Cd2+胁迫下接种DSE对龙葵生物量的影响

无论是否接种 DSE，与无Cd2+胁迫的对照相比，Cd2+胁迫显著抑制了龙葵的生长。但在同一Cd2+浓度下，与未接种DSE处理相比，接种 DSE 菌株NBC8-7缓解了Cd2+胁迫导致的抑制作用，增加了龙葵地上部和地下部的生物量，并且在Cd2+浓度为10 mg/kg和15 mg/kg处理下都达到了显著差异（P＜0.05）（图 5）。

图5 接种DSE对龙葵地上部和地下部干重的影响Fig.5 Effects of DSE inoculation on shoot/root dry weight of Solanum nigrum

2.4 接种DSE对龙葵地上部和地下部Cd含量的影响

由图6 可知，随着Cd2+浓度的增加龙葵地上部和地下部的 Cd 含量显著升高。在不同浓度Cd2+处理下，接种DSE均显著提高了龙葵地上部Cd 含量，而龙葵地下部Cd 含量均有所下降。在Cd2+浓度为5 、10 、15 mg/kg胁迫下，与未接种DSE处理相比，地上部Cd 含量分别增加了37.26%、18.99%和22.54%，地下部Cd 含量分别下降了5.19%、5.23%和2.82%。

通过对龙葵转运系数和富集系数（表2）的分析可知，随着Cd2+浓度的增加龙葵的转运系数和富集系数均呈现增加的趋势，其中富集系数在不同Cd2+浓度间差异达显著水平，而转运系数差异不显著。在不同Cd2+浓度胁迫下，接种DSE均显著降低了龙葵的富集系数，降幅在0.04～0.09范围内，而转运系数均显著升高，增幅在 0.18～1.14 范围内。

图6 接种DSE对龙葵地上部和地下部Cd含量的影响Fig.6 Effects of DSE inoculation on Cd content of shoot/root of Solanum nigrum

表2 接种DSE对龙葵富集系数和转运系数的影响Table 2 Effects of DSE inoculation on bioaccumulation and translocation factors of Solanum nigrum

3 讨论

本研究通过接种DSE进行土壤培养试验发现，接种DSE后土壤可交换态和铁锰氧化态Cd含量增加，而碳酸盐结合态Cd、有机结合态Cd和残渣态Cd含量降低，并且当土壤Cd2+浓度≥10 mg/kg时接种DSE对土壤重金属Cd赋存形态的影响均达到了显著水平（P＜0.05）。说明接种DSE使土壤重金属Cd由活性较强的赋存形态向稳态转化，从而降低重金属Cd的生物有效性。王风等［21］通过分析土壤 pH与土壤重金属 Cd 赋存形态的相关性发现，土壤 pH与交换态Cd 和铁锰氧化物结合态Cd 含量存在显著负相关，与有机结合态Cd 和残渣态Cd 含量存在显著正相关关系。侯青叶等［22］的研究认为，pH的提高有利于土壤铁锰氧化态Cd含量的增加。在重金属镉胁迫下，DSE应激表达有机酸代谢和转运、金属离子结合和转运蛋白、抗氧化清除蛋白等功能基因［23-24］。土壤中的重金属Cd通过溶解、沉淀、凝聚、络合吸附等反应形成不同的赋存形态，在此过程影响其赋存形态的关键因素是pH值。据此推测，本研究结果可能是由于在重金属Cd胁迫下，一方面DSE增强金属离子结合和转运蛋白的表达络合Cd2+；另一方面DSE有机酸代谢增强，在菌丝表面产生更多能与H+结合的有机酸根 —COO-，从而使土壤pH值升高。土壤 pH 的升高使得土壤胶体颗粒表面的负电荷增加，从而增强土壤对 Cd 的吸附，并且也会促进 CdCO3与Cd(OH)2沉淀的生成，使土壤中的重金属Cd 由活性较高的可交换态向活性较低的形态转化［25-26］。在潮土中，交换态Cd对H2O2酶活性抑制作用贡献最大，有机结合态Cd对脲酶活性有较大抑制作用［27］。

DSE与植物共生能够提高宿主植物的抗逆性。Li 等［28］通过研究不同重金属处理下DSE（Exophiala pisciphila）对玉米生长及吸收重金属的影响，发现E.pisciphila能够提高玉米的生物量，降低宿主植物对重金属的吸收，玉米吸收的重金属主要固持在根部从而减轻重金属的毒害作用；班宜辉［10］的研究表明，接种柱孢顶囊壳（G.cylindrosporus）明显提高了玉米的生物量、苗高和根系活力，同时更多的 Pb 积累在植物根部，缓解Pb 对植物的毒害作用。与上述研究结果不同，本研究发现，重金属镉胁迫下，DSE菌株NBC8-7在龙葵根内形成良好的定殖结构，促进龙葵地上部和地下部的生物量；但接种DSE显著提高了龙葵地上部Cd 含量，而龙葵地下部Cd 含量均有所下降，并且转运系数均显著升高。根不仅是养分水分的吸收器官，而且可以感受土壤状况所产生的化学信号，并将这些信号传递到地上部，从而控制地上部器官的生理活动。重金属离子在植物根内累积会使根受到伤害，进而影响到植物体的生长发育。接种DSE菌株NBC8-7后增强了植物根部向地上部运输Cd2+的能力，这可能也是DSE提高植物抗逆性的策略之一。同时也说明，DSE增强植物抗重金属伤害的机制会因DSE和宿主植物种类不同而有所差异。因此，在利用DSE—植物联合修复技术改善重金属污染土壤时，要根据宿主植物的生长特性、可利用部位及收获的便利性来选配适宜的植物种类和DSE菌剂。

4 结论

（1）接种DSE使土壤重金属Cd由活性较强形态向稳态转化，交换态 Cd 和铁锰氧化态Cd 含量显著降低，而碳酸盐结合态、有机结合态和残渣态Cd含量显著增加。

（2）Cd2+胁迫下，DSE菌株NBC8-7促使重金属镉由富集植物龙葵根部向地上部转移，转运系数显著升高。

（3）Cd2+胁迫下，DSE菌株NBC8-7与富集植物龙葵形成良好的共生体，增加了龙葵生物量。