山楂原花青素的大孔吸附树脂纯化及动脉血管舒张作用

刘丽南，高 哲，康小虎，陈 灿，崔 同

（河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000）

山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）具有消食健胃，活血化瘀的功效，自古就是重要的“药食两用”的生物资源。而现代医药学的探索则源于上世纪80年代欧洲山楂（叶）标准化提取物的系统研究［1］，这导致了主要活性成分黄酮和原花青素的一系列药理活性的发现，包括抗氧化［2］、保护心血管等方面［3］，进而被用于NYHA II/III级瘀血性心衰的治疗［4-5］。血管生理学研究表明，动脉内皮细胞可通过合成并释放一氧化氮，再经一系列信号传导，最终启动血管平滑肌的舒张而增加血流，这一重要发现使三位美国科学家获得了1998年诺贝尔生理/医学奖［6］。韩国学者证实了，欧洲山楂标准化提取物中的原花青素而非黄酮具有内皮依赖性血管舒张作用［7］。本研究组采用高效液相色谱（HPLC）分析发现，中国山楂鲜果中原花青素的含量高达4 mg/g，是其最主要的酚类成分［8］，开发的水提醇沉和溶剂萃取法可制备高纯度山楂原花青素［9］。而近年植物原花青素的提取更倾向于采用大孔树脂吸附法［10-11］。一些学者借鉴葡萄籽原花青素制备工艺，比较了多种型号的树脂对山楂原花青素的吸附分离效果，认为非极性的D101型树脂性能更好［12-13］。然而氢键型吸附树脂理应对极性较强的原花青素有更好的相互作用。此外用树脂法制备的提取物是否具有确切的内皮依赖性舒张动脉血管的活性，目前尚未见报道。

本研究选用孔径较小、表面积更大的氢键型HPD826树脂与经典的D101型作比较，通过分析其吸附-解吸特性优化分离方法，精制的山楂原花青素经HPLC表征，采用经典的鼠动脉环张力试验法进行内皮依赖性舒张血管作用评价，以期获得山楂原花青素的优化制备方法，及其活血化瘀功效的可靠实验证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

山楂，购买于河北省保定市南市区南二环水果批发市场，产地为河北省兴隆县，品种为大金星；对照品原花青素D6、C3、B2、C1、D1、E1、C2、D2、B5和表儿茶素（EC），由本实验室从大金星果实中分离提取［14］，经ESI-MS法和硫解法鉴定后与文献［8,15,16］相一致；D101、HPD826型大孔吸附树脂，购买于沧州市宝恩化工有限公司；HPLC流动相甲醇、乙腈为色谱级，水为高纯水。

1.2 主要仪器

UV-2802H型紫外可见分光光度计，购买于上海市尤尼科仪器有限公司； 玻璃中压层析柱（18 mm × 600 mm），购买于上海市楚定分析仪器有限公司；1200型HPLC系统，购买于美国安捷伦科技有限公司；SQG-4四腔器官浴槽系统、HSS-1(B)型恒温水浴槽、BL-420E+生物机能实验系统，购买于四川省成都市仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 粗提液制备 将鲜山楂切片按料液比1:1.5（w/w）加入95%的乙醇充分浸提24 h，将浸取液收集起来。残渣再用80%乙醇浸提2次，同上。然后合并乙醇浸提液用旋转蒸发仪减压浓缩（45 ℃）至可溶性固形物含量为50%左右。

1.3.2 吸附容量测定 称取2种预处理的大孔树脂各2.00 g于具塞磨口三角瓶中，加入粗提液10 mL、水40 mL，于25 ℃恒温摇床上，以120 r/min振荡24 h，取滤液适当稀释后用UV法在280 nm下测定吸光度值［17-18］，并与原液测定结果比较，计算各树脂的吸附容量（mg/g）。

1.3.3 解吸率测定 取充分吸附后的HPD826和D101树脂用纯净水进行充分清洗、然后用布氏漏斗抽干排除水分，最后分析天平称重。分别加入45%乙醇50 mL，于25 ℃、120 r/min，振荡24 h，取适量滤液在280 nm波长下测定吸光度，计算解吸率（%）。然后，用90%乙醇对树脂中的残留成分再处理，并同上计算解吸率（%）。

式中：J为解吸率（%）；C2为解吸液中质量浓度（mg/mL）；V2为解吸液体积（mL）；R为吸附量（mg/g）；M为树脂质量（g）。

1.3.4 静态吸附动力学曲线 重复1.3.2处理，每隔1 h取样用UV测定吸光度值，计算树脂吸附量并对时间t作图，绘制出各个树脂的静态吸附动力学曲线。

1.3.5 动态吸附-解吸条件 将HPD826树脂湿法装柱（18 mm × 600 mm），装填量120 mL。取浓度为25 mg/mL的山楂原花青素粗提溶液以1.5 mL/min的流速进行上柱，以每管30 mL的体积收集流出液，用UV法测定吸光度值，当流出液浓度达进样浓度（C/C0）1/10 时认为达到穿透点，计算吸附通量。以流出液体积（BV：以层析柱中填料的体积为一个床体积）为横坐标、浓度比（C/C0）为纵坐标，绘制吸附透过曲线。上样结束后，依次以水1.5 BV，45%乙醇1.5 BV，90%乙醇1 BV，水2 BV，以1.5 mL/min的流速解吸。分部收集流出液（30 mL/管）UV法监测，并以流出液体积（BV）为横坐标、原花青素浓度为纵坐标，绘制解吸曲线。

1.3.6 树脂提取物组分分析 收集45%乙醇洗脱液，在45℃下旋转蒸发除去乙醇，真空冷冻干燥，得到精制的山楂原花青素粉末，用HPLC法［14］以原花青素对照品为参比，外标法定量分析各组分的含量。

1.3.7 离体主动脉环的制备［19］采用颈椎脱臼手术的方法处死1只大鼠后，迅速用消毒干净剪刀打开胸腔，取出胸主动脉放置于4 ℃ K-H液［19］中（此液体已经用95% O2+ 5% CO2混合气体预先饱和的），然后用脱脂棉清除血管周围脂肪和结缔组织，依次截取长约4 mm的胸主动脉环，操作时应该注意避免过度牵拉，防止外力损伤内皮，检查血管环的内皮完整性。将血管环一端固定于浴槽中，加入5 mL K-H液，并不断地向浴槽中通入95%O2+ 5%CO2混合气体，另一端连接于张力换能器，通过BL-420E+生物机能实验系统将动脉环张力和舒缩活动变化输入计算机进行储存和分析。保持37 ℃恒温，调节静息张力至2.0 g。

1.3.8 主动脉环舒张作用 试验分3组：溶剂对照组、内皮完整组、去内皮组。加入 1 mmol/L盐酸去氧肾上腺素（PE）5 μL（终浓度 1 μmmol/L）使动脉环预收缩，至收缩达到平台，记录收缩张力TPE。采用累积加药法每隔5 min加药一次，逐步加入树脂纯化物受试溶液 0.5、1.0、3.5、10、35 μL，使终浓度分别达到1.4、4.2、14、42、140 mg/L，记录血管环张力的变化。

1.4 数据统计处理

试验得到的数据以实测值的均值±标准误（mean ± S.E.M.）来表示。统计学处理和图形处理使用 Orijin9.1软件处理。

2 结果与分析

2.1 树脂的静态吸附-解吸性能比较

选取D101树脂和HPD826树脂，按1.3.2和1.3.3进行静态吸附-解析性能测定，结果见表1。由表1可以看出，HPD826型树脂的吸附量为159 mg/g，优于D101型；45%乙醇解析量和解吸率也优于D101型。90%乙醇解吸率偏低可能是HPD826型树脂孔径稍小，吸附的高聚合度成分的比例偏低所致。

表1 两种大孔吸附树脂对山楂果原花青素的静态吸附及解析性能Table 1 The adsorption and desorption properties of two resins on hawthorn procyanidins

2.2 静态吸附动力学比较

按照1.3.4方法比较D101和HPD826树脂的静态吸附动力学曲线如图1所示。从图1中可以看出在1.5 h后吸附量的变化幅度很小，甚至趋近于平衡，即说明此时树脂已接近吸附饱和，由此可以表明，这2种树脂在对原花青素的吸附过程中都属于快速平衡型。

图1 2种树脂的吸附动力学曲线Fig.1 Adsorption kinetic curves of two resins

2.3 树脂的吸附速率比较

为更加准确清晰的定量比较2种树脂对原花青素的吸附速度，本研究中采用了Langmuir单层吸附模型拟合吸附速率方程，便可求出其吸附平衡速率常数，得到HPD826树脂对原花青素的吸附速率为1.065 5，比D101树脂0.9011相对较大（见表2）。

综合以上各结果分析，最终确定HPD826树脂暂时为较适宜纯化大金星山楂果原花青素的树脂类型。以下试验均采用HPD826树脂进行研究。

表2 树脂平衡速率常数Table 2 Resin equilibrium rate constant

2.4 样品液浓度对吸附效果的影响

按1.3.5方法，改变粗提液样品浓度分别为10、25、35 mg/mL进行动态吸附比较，测得流出曲线如图2所示。由图2可知，较低的样品浓度会使上样时间延长到数小时，不仅会影响生产效率，同时有效成分也有氧化分解的隐患。而过高的样品浓度一方面穿透出现过早，吸附不充分而导致有效成分的损失，另外还有可能会出现絮凝和沉淀，造成树脂的污染和堵塞。因此采用25 mg/mL的浓度较合适。此外还比较了不同的上样浓度对树脂吸附量的影响，结果3种浓度的吸附总量差异不明显（数据从略）。

图2 不同浓度样液在HPD826树脂上的吸附透过曲线Fig.2 The adsorption breakthrough curve of procyanidins with different sample concentration on HPD826

2.5 流速对吸附效果的影响

按1.3.5方法上样，设样液流速分别为0.68、3和5 BV/h，比较不同的上样流速对吸附效果的影响，结果如图3所示。

图3 上样流速对树脂吸附效果的影响Fig.3 Effect of sample speed on adsorption

从图3可知，随上样流速的增大，原花青素的吸附量会显著降低，这是因为传质阻力的影响，但若流速过小，则会使吸附操作周期延长生产效率下降。综合考虑选择1.5 BV/h 的上样速度。解吸流速同样，如果过快洗脱带会变宽且拖尾严重；流速过慢，会影响生产效率。所以本试验采用1.5 BV/h的解吸流速。

2.6 洗脱程序的确定

按1.3.5方法上样之后，按照水、45%乙醇、90%乙醇各2 BV水的顺序依次进行洗脱，同时用手持折光仪监测流出液的含糖量，结果发现，当水洗至1.5 BV时，接收液折光已经降低到0，说明样液中的糖类溶质已基本洗出。而对45%乙醇洗脱馏分的原花青素含量分析结果表明，经1.5 BV洗脱后主要成分都已经洗出，因此为压缩时间周期，选用1.3.5所述的洗脱程序。图4显示此解吸程序的洗脱结果，可以看出，45%乙醇洗脱部分是原花青素含量最高的部分，再经1 BV的90%乙醇洗脱，到4 BV时已经完全基本洗脱干净，无原花青素洗出，洗脱峰的对称性从图中显示也明显较好，目标成分收集相对集中，并没有明显的拖尾现象。最后再用2 BV水洗出乙醇完成一次吸附-解吸的循环，使树脂净化再生。经计算，45%乙醇解吸部分中原花青素的回收率达81.5%。

图4 大孔树脂的洗脱程序和原花青素流出曲线Fig.4 Elution procedure of macroporous resin and procyanidin elution curve

2.7 树脂纯化物液相色谱分析

采用此前建立的HPLC方法［14］对制备的山楂原花青素提取物进行测定，10种原花青素对照品和样品的色谱图如图5所示。

图5 原花青素对照品（A）和树脂纯化物样品（B）的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of procyanidin reference standard（A）and resin purified sample（B）

由图5可见，树脂纯化物中主要成分为原花青素EC和B2，此外还含有少量的3聚体，四聚体以上的成分以及其他未知的具有紫外吸收的成分含量很少。以10种对照品统计，树脂纯化物中的原花青素组分总含量占其干重的42%。

2.8 山楂原花青素对PE预收缩的大鼠胸主动脉环的舒张作用

采用1.3.7、1.3.8所述方法，评价了山楂原花青素对大鼠动脉环的舒张作用。由图6可已看出，对于内皮完整的大鼠胸主动脉血管，原花青素提取物在1.4～140 mg/L浓度范围能对PE（1 μmol/L）诱发的收缩产生舒张作用，有统计学意义（P＜0.01）；而对去内皮的大鼠胸主动脉环，在1.4～140 mg/L浓度范围各处理的舒张作用与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图6 山楂原花青素对PE预收缩大鼠胸主动脉环的舒张作用Fig.6 Relaxant effects of hawthorn procyanidins in rat isolated thoracic aorta rings precontracted by PE

3 讨论与结论

山楂果实中的原花青素含量高且平均聚合度低［8,16］，是十分重要的膳食原花青素资源，对山楂原花青素的分离，有研究推荐使用D101型树脂［12-13］，本研究采用HPD826氢键型大孔吸附树脂对山楂原花青素粗提物进行吸附分离，效果优于报道的D101型树脂。

粗提物的制备过程应尽量去除果胶等水溶性高分子成分，以免其对树脂的表面和孔隙产生阻塞干扰，为此本文使用较高浓度的乙醇为提取剂。树脂的解吸没有直接使用较高的洗脱强度［12,17］，而是采用了分段洗脱程序，先用中等浓度（45%）的乙醇溶液解吸，以获得80%以上的目标组分，随后再用强洗脱条件（90%乙醇）解吸残余组分并活化树脂。这样可以将粗提物中共存的弱极性杂质以及较高聚合度的部分切割出来，以保证主要部分的纯度和质量。所获得的原花青素提取物中10种已知成分的总含量达到42%，相当于将山楂果中的主要原花青素成分浓缩了100倍。这将为进一步的研究以及后期工业化生产提供了重要的数据。

血管细胞内积累大量的有害物质会逐渐破坏血管功能的完整性，从而导致血管内皮的损伤，引发高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病［19］。血管舒张功能根据血管内皮功能一般分为内皮依赖性血管舒张功能和非内皮依赖性血管舒张功能，正如学者所述山楂的水提取物具有内皮依赖性舒张血管的活性［20-21］。本试验的树脂纯化物对内皮完整的血管具有一定的舒张作用，而对于去内皮组，没有显示出舒张作用，这说明树脂纯化物可能是通过内皮发挥血管舒张效应，但其作用机制还需进一步研究。由此结果推测山楂中具有内皮依赖性血管舒张作用的主要有效成分可能是原花青素类物质。

通过本试验的大孔树脂吸附分离方法，批量制备了山楂原花青素，采用经典的大鼠主动脉环张力试验法进行评价，受试物具有很强的内皮依赖性舒张动脉血管的作用。这不仅为解释山楂活血化瘀功效提供了可靠的试验依据，同时也为山楂保健资源的开发利用提供了重要的技术支撑。