口腔鳞状细胞癌中PD-L1的表达与P16、HPV感染以及淋巴结转移关系分析

杜静冰，崔银江，孔耀

（新乡市中心医院 口腔科，河南 新乡453000）

头颈部是恶性肿瘤常发部位之一,头颈部恶性肿瘤的发病率居于所有恶性肿瘤的第六位,其中口腔鳞状细胞癌是其主要类型,全球每年新增口腔鳞状细胞癌也在45万[1]。口腔鳞状细胞癌预后不良，且在过去50年内其临床治疗预后并未得到明显的改善。对于口腔鳞状细胞癌这种实体肿瘤而言，目前已经发现了多种免疫应答逃逸机制,如调节性T细胞的免疫聚集就是其中最常见的一种[2]。最新研究显示，程序性死亡分子-L1(PD-1)可表达于肿瘤细胞膜表面,其配体如PD-L1可表达于抗原提呈细胞、活化的T细胞及肿瘤细胞中，PD-L1可调节T细胞免疫聚集来激活肿瘤细胞的炎性破坏，因此,阻断PD-1/PD-L1通路可逆转肿瘤免疫抑制，从而达到抗肿瘤治疗的目的[3,4]。但PD-L1与口腔鳞状细胞癌病情发展标志物的关系尚未见报道,鉴于此，本研究以本院近期收集到的口腔鳞状细胞癌组织蜡块为研究标本,观察口腔鳞状细胞癌中PD-L1的表达与乳头瘤病毒-16(P16)、人乳头瘤病毒(HPV)感染以及淋巴结转移有关，并初步探讨PD-L1在口腔鳞状细胞癌病情发展中的作用，为口腔鳞状细胞癌免疫疗法提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院于2017年6月至2018年6月期间手术治疗的口腔鳞状细胞癌51例，所有患者均经临床组织学病理证实为口腔鳞状细胞癌，且临床病理资料完整。51例口腔鳞状细胞癌患者：性别比：男27例，女24例；平均年龄53.81±5.74周岁(年龄跨度36～64周岁)；美国癌症联合会淋巴结转移临床分期：Ⅰ期17例、Ⅱ期14例、Ⅲ期14例、Ⅳ期6例。

1.2 研究方法 所有患者手术病灶组织蜡块标本均采用磷酸缓冲液配置的甲醛固定液固定,并采用乙醇梯度脱水,以石蜡包埋,于本院病理中心作4μm连续切片。采用免疫组化染色法检测口腔鳞状细胞癌组织标本PD-L1、P16及HPV表达情况，染色过程中兔抗人PD-L1单克隆抗体、兔抗人P16单克隆抗体、兔抗人HPV单克隆抗体均采用PBS溶液1：150稀释，然后进行SP免疫组化染色。采用双盲法由2名研究人员判定染色结果,每份染色结果观察(×200)。染色结果判定方法为[8]：首先对染色结果的强度进行评价，并按颜色深浅度分为无着色(计 0 分)、淡黄色(计 1 分)、棕黄色(计 2 分)、棕褐色(计3分);然后按照每个视野阳性细胞占比进行计分,即占比≦5%计0分、占比5%～25%计1分、占比25%～50%计2分、占比50%～75%计3分、占比≧75%计4分;最后将两种计分相加,所得分数0～4分为阴性,5～6分为弱阳性，7分为强阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学处理与分析。阴性率、阳性率等分类资料采用频率(%)表示，年龄等计数资料以均数±标准差表示。采用Spearman等级相关性分析法分析口腔鳞状细胞癌中PD-L1的表达与P16、HPV感染以及淋巴结转移关系的相关性,P＜0.01为差异有统计学意见义。

2 结果

2.1 PD-L1及P16在口腔鳞状细胞癌组织中表达情况分析 51例口腔鳞状细胞癌组织中，PD-L1呈阳性表达44例 (86.27%)，PD-L1呈阴性表达7例 (13.72%),其中PD-L1强阳性表达31例(60.78%),PD-L1弱阳性表达 11例(21.57%)，见图1。51例口腔鳞状细胞癌组织中，P16呈阳性表达22例(43.14%)，P16 呈阴性表达 29 例(56.86%)，其中 P16强阳性表达9例 (17.65%)，P16弱阳性表达13例(25.49%)，见图 2。

图1 PD-L1在口腔鳞状细胞癌组织中的表达(×200)

图2 P16在口腔鳞状细胞癌组织中的表达(×200)

2.2 口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1与P16的相关性分析 经Spearman等级相关性分析显示,口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与P16表达呈负相关 (rs=-0.819，P=0.000)，即口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阳性表达44例中，29例P16表达呈阴性，而口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阴性表达7例中，全部P16表达呈阳性。见表1。

表1 口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1及P16之间的相关性分析表

2.3 口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1与淋巴结转移分期的相关性分析 经Spearman等级相关性分析显示:口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与淋巴结转移分期之间呈负相关（rs=-0.736，P=0.000），即口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阳性表达44例中，17例为NO分期0期，14例为NO分期1期，13例为NO分期2期,而口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阴性表达7例中，1例为NO分期2期，6例为NO分期3期。见表2。

表2 口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1及淋巴结转移分期之间的相关性分析表

2.4 口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1与HPV感染的相关性分析 经Spearman等级相关性分析显示：口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与HPV感染呈正相关(rs=0.653，P=0.000)，即口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阳性表达44例中，39例为HPV表达阳性，5例为HPV表达阴性，而口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阴性表达7例中，1例为HPV表达阳性，6例为HPV表达阴性。见表3。

表3 口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1与HPV感染之间的相关性分析表

3 讨论

口腔鳞状细胞癌被认为是一种免疫性疾病，其病情发展与高度的免疫抑制密切相关[5]。而最新研究显示细胞表面PD-L1的高表达是口腔鳞状细胞癌潜在的发病机制,其通过PD-L1与PD-1结合触发抑制性信号,从而抑制T细胞免疫效益或消弱其肿瘤细胞杀伤能力[6]。当前,以PD-L1与PD-1信号通路为靶向的免疫治疗在临床试验中已经取得了一定的进展,同时也有研究显示这种免疫治疗的临床取决于肿瘤细胞膜中PD-L1的表达情况，表明PD-L1的有效控制在口腔鳞状细胞癌免疫治疗中起到重要作用[7,8]。但PD-L1与口腔鳞状细胞癌病情进展的关系尚未见报道,对此进行研究可为抑制性分子PD-L1来介导免疫抑制提供理论参考。

本研究采用免疫组化染色法检测了51例口腔鳞状细胞癌患者组织中PD-L1表达情况,结果显示：51例口腔鳞状细胞癌组织中，PD-L1呈阳性表达44例(86.27%)，这与既往研究报道[9,10]基本吻合（76.4～91.0%）。对于PD-L1在口腔鳞状细胞癌组织中高表达的机制,有如下推测：PD-1/PD-L1通路可在恶性肿瘤进展期间对免疫功能具有一定的抑制作用,但是由于主要淋巴器官能激发强烈免疫应答的外源性抗原,因此导致T淋巴细胞的反向应力作用，导致特异性的调高PD-L1表达[11]。P16是一种HPV感染而形成的替代性指标,在许多实体肿瘤研究已经证实于口腔鳞状细胞癌病情进展有关，其低表达可导致HPV感染加重[12]。本研究51例口腔鳞状细胞癌组织中，P16呈阳性表达22例(43.14%)，P16 呈阴性表达 29 例(56.86%)，而在口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阳性表达44例中，29例P16表达呈阴性,而口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阴性表达7例中，全部P16表达呈阳性，可见口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与P16表达存在一定的相关性，这一研究结果与Farrow[13]研究结果相符。同时本研究还显示，口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与P16表达呈负相关(rs=-0.819，P=0.000),提示PD-L1高表达在一定程度上可促进P1 6低表达，从而促进口腔鳞状细胞癌病情进展。

在口腔鳞状细胞癌临床危险因素研究中，除吸烟和酗酒外，HPV感染也是口腔鳞状细胞癌的重要的危险因素[14]。在美国，口咽鳞状细胞癌的发病有40%～80%是由于HPV感染所引起，其机制被认为是长期HPV感染所引起的免疫功能下降所导致的癌变[15]。有研究指出，HPV感染也是导致口腔鳞状细胞癌患者趋于年轻化的重要原因,且HPV阳性的口腔鳞状细胞癌患者临床治疗预后明显差于HPV阴性的口腔鳞状细胞癌患者[16]。本研究结果显示,口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与HPV感染呈正相关(rs=0.653，P=0.000)，即口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阳性表达 44例中，39例为HPV表达阳性，5例为HPV表达阴性，而口腔鳞状细胞癌组织PD-L1阴性表达7例中，1例为HPV表达阳性，6例为HPV表达阴性。这研究结果表明，PD-L1高表达与HPV感染有一定的关系，其可能机制为口腔鳞状细胞癌患者的HPV感染起源于扁桃体,即通过扁桃体感染来调节口腔中的主要淋巴器官,导致HPV感染的扁桃体隐窝深部淋巴组织细胞长期与高浓度的外来免疫抗原接触，从而导致扁桃体隐窝处高表达的HPV并对下调T细胞的功能，最终促进PD-L1的高表达，从而形成HPV病毒感染后的口腔鳞状细胞癌免疫逃避机制和恶性转化机制[17]。可见HPV感染可促进PD-L1高表达,从而促进口腔鳞状细胞癌病情进展。本研究进一步研究还显示口腔鳞状细胞癌组织中的PD-L1表达与淋巴结转移分期之间呈负相关 (rs=-0.736，P=0.000)，即口腔鳞状细胞癌组织中的PDL1高度表达,在一定程度上可促进淋巴结转移。在国内外文献中对此缺乏统一结论，多数研究认为口咽鳞状细胞癌PD-L1的高表达与淋巴结转移分期有关[18,19]，另有研究报道认为口腔鳞状细胞癌组织中PD-L1高表达仅与远处转移,其作用机制也与长期HPV感染所导致的口腔鳞状细胞癌免疫逃避机制和恶性转化机制有关[20]，因此PD-L1的高表达也可促进淋巴结转移,也与口腔鳞状细胞癌病情进展密切相关。

综上所述，本文结果显示，PD-L1在口腔鳞状细胞癌组织中呈高度表达，且与P16低表达、HPV感染以及淋巴结转移密切相关,与P16低表达、HPV感染以及淋巴结转移共同促进口腔鳞状细胞癌病情进展。尽管PD-L1可通过P16、HPV感染及淋巴结转移来抑制口腔鳞状细胞癌患者免疫功能，在临床免疫靶向治疗中也得到了重视，但由于PD-L1生物学特征及信号转导途径尚未完全明确,因此仍然需要以更大的前瞻性研究来证实PD-L1在口腔鳞状细胞癌病情发展的作用,才能真正有助于口腔鳞状细胞癌免疫疗法的完善。