铁皮石斛根、茎和叶中内生真菌分离与鉴定

雒晓芳　许淑娟　陈丽华　王冬梅　张璐　费孝桐　赵梓彤

摘要：目的  分離鉴定铁皮石斛的内生真菌，为铁皮石斛的开发利用提供依据。方法  以多种培养基为基础分离培养基，分别从铁皮石斛的根、茎和叶中分离内生真菌，采用平板划线法对分离得到的菌株进行纯化，并观察其菌落形态。利用形态学、生理生化分子特性及分子生物学手段鉴定内生真菌。结果  分离得到7株铁皮石斛内生真菌，根、茎和叶中的真菌种类和数量各不相同，仅X1菌株同时存在于根、茎和叶部位。通过对性状稳定的3株真菌进行分子生物学鉴定，XJ1与链格孢菌Alternaria sp.的16S rDNA序列有99%的同源性，XY6与链格孢菌Alternaria sp.的16S rDNA序列有93%的同源性，X1菌株与好食链孢霉菌Neurospora africana的16S rDNA序列有99%的同源性。结论  本研究分离并鉴定了铁皮石斛根、茎和叶中的内生真菌，可为铁皮石斛资源的开发利用提供依据。

关键词：铁皮石斛;内生真菌;分离;鉴定

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）03-0057-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201810125

Isolation and Identification of Endophytic Fungi in Roots， Stems and Leaves of Dendrobium officinale

LUO Xiaofang1， XU Shujuan2， CHEN Lihua3， WANG Dongmei1， ZHANG Lu1， FEI Xiaotong2， ZHAO Zitong2

1. Center of Experiment， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China;

2. College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China;

3. School of Chemical Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China

Abstract： Objective To isolate and identify the endophytic fungi in different tissues of Dendrobium officinale; To provide basis for development and utilization of Dendrobium officinale. Methods The endophytic fungi was isolated from the roots， stems and leaves of Dendrobium officinale by using various basal culture media. The isolated strains were purified by the plate streaking， and their colony morphology was observed. Endophytic fungi were identified by morphological， physiological and biochemical molecular characteristics and molecular biological methods. Results Seven strains of endophytic fungi were isolated. The quantity and species of microorganisms differed in roots， stems and leaves. Only X1 existed in roots， stems and leaves at the same time. Three strains of fungi with stable characters were identified by molecular biology. By molecular bioassay of three fungi with stable traits， XJ1 had 99% homology with the 16S rDNA sequence of Alternaria sp.; XY6 had 93% homology with the 16S rDNA sequence of Alternaria sp.; X1 strain had 99% homology with the 16S rDNA sequence of Neurospora africana. Conclusion This study isolates and identifies endophytic fungi from the roots， stems and leaves of Dendrobium officinale， which can provide a basis for the development and utilization of Dendrobium officinale resources.

Keywords： Dendrobium officinale; endophytic fungi; isolation; identification

铁皮石斛Dendrobium officinale为兰科石斛属多年生草本植物，不仅是传统的珍贵中药材，也具有很高的观赏价值。铁皮石斛广泛分布于安徽、浙江、云南、广西、广东等地，其生长缓慢，自身繁殖力低，需要与内生菌共生才能完成生活史。

微生物与植物体相互作用关系由来已久，大多数植物体的根、茎、叶都分布着数量和种類众多的微生物[1]。微生物与植物体的相互作用对植物的生长发育具有重要作用。内生菌作为植物微生态系统中的天然组成部分，对植物具有多方面的积极作用。在生物防治上，植物内生菌系统地分布于植物体内，有充分的碳源和氮源的供应，比暴露于外界的恶劣环境中更有利于发挥作用[2]。

铁皮石斛含有多种内生真菌，一些内生真菌能有效促进其生长发育，并在组织和宿主中表现出一定的差异[3]。铁皮石斛内生真菌是筛选新活性物质的重要资源[4-10]。本试验以铁皮石斛根、茎和叶为试验材料，分离铁皮石斛不同部位的菌株，对其进行比较鉴别，为铁皮石斛的进一步开发利用提供试验依据。

1  材料

在云南省普洱市宁洱县五里坡选取生长优良、表面无病虫害的仿野生生长3年以上的铁皮石斛整个植株，经西北民族大学生命科学与工程学院郭鹏辉鉴定为铁皮石斛Dendrobium officinale。

培养基购自杭州微生物有限责任公司，批号20180706-00。①麦芽汁琼脂培养基：氯霉素0.1 g，麦芽膏粉30 g，琼脂15 g，加水定容至1 L，121 ℃高压灭菌30 min。②马铃薯琼脂糖培养基：土豆冲洗干净并去皮，取200 g切成小块，加入纯水1 L，煮沸30 min，补纯水至1 L。在滤液中加入10 g琼脂，煮沸后加入20 g糖，溶解，补水，121 ℃灭菌30 min。③高盐察氏培养基：氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，氯化钠60 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，加水定容至1 L，121 ℃高压灭菌30 min。④营养琼脂培养基：牛肉膏1 g，酵母膏2 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，加水定容至1 L，调pH值为7.4，加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。⑤LB固体培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，加水定容至1 L，调pH值至7.4，加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。

盐酸、蔗糖、氢氧化钠、无水乙醇、异丙醇、10%SDS、双氧水、1×TAE（pH 8.0）、1%氯化汞、亚硫酸钠、硫酸双氢链霉素、青霉素G钾、10 mg/mL Rnase（Sigma）、PCR试剂盒、乳酸石炭酸棉蓝染色液、5%石炭酸复红染色液。

2  方法与结果

2.1  菌种筛选

2.1.1  初筛

选取新鲜健康铁皮石斛植株的根段、茎段和叶片，用流水冲洗干净，去除表面杂土颗粒后带入无菌操作台中，用75%酒精表面消毒20 s，无菌水冲洗3次，0.1%氯化汞浸泡消毒3～5 min，再用无菌水浸洗4次。滤干后将样品置于培养皿中，用无菌刀片将其切成2～3 mm薄片，弃去两头切片，选取中间切片，按照插片法将切片等距离均匀分别放置于含链霉素（50～100 mg/L）和青霉素（100～300 mg/L）的5种固体培养基（麦芽汁琼脂培养基、高盐察氏培养基、营养琼脂培养基、LB固体培养基、马铃薯琼脂糖培养基）上，3～4片/皿。于26 ℃黑暗条件下培养5～10 d，待切片周围长成肉眼可见的菌落时，以平板划线法用接种环立即挑取单个菌落移入另一个平板上，四区划线分离真菌，继续培养。

2.1.2  复筛

将初筛获得的优势菌种用平板划线法进行纯化分离，连续富集培养3次。当富集培养均无杂菌出现，用平板划线法进行菌株的分离纯化，重复3次。肉眼观察培养特征，选择生长优良的菌株。将得到的单菌株接种到斜面上，26 ℃培养3～5 d，置于4 ℃冰箱保存备用。

2.2  菌种鉴定

2.2.1  形态学鉴定

用5种不同的固体及对应的液体培养基经初筛、富集培养及分离纯化，从叶中分离出5株真菌，从茎中分离出2株真菌，从根中分离出2株真菌，共得到7株铁皮石斛优势内生真菌，分别编号为XY6、XY4、XY1、XY5、XJ1、XG2、X1。菌落形态见图1、表1。将纯化的菌株用0.5%石炭酸复红染色液或乳酸石炭酸棉蓝染色液简单染色后观察形态。结果见图2。

XY6菌落在营养琼脂培养基上26 ℃培养4 d即形成较典型的菌落，菌落整体较为平坦，中心有脐状突起，而其他部分有少量放射状短纹，边缘明确、整齐，质地绒状，分生孢子面淡褐色;菌丝体为白色，具隔膜。石炭酸复红染色后孢子着色较深，仅观察到分生孢子为棒状，孢子上有环痕，判断分生孢子为环痕孢子。根据XY6菌株的培养特征及染色后显微镜下形态观察，借助《真菌鉴定手册》[11]及《中国真菌志》[12]对该菌株进行鉴定，确定该菌株应为半知菌类、丝孢纲、丛梗孢目、暗丛梗孢科某真菌。

XJ1菌落在高盐察氏培养基上28 ℃培养7 d即形成较典型的菌落，中心有突起，质地绒状，边缘不整齐，边缘的菌丝体白色，中部呈绿色，反面暗绿色。根据XJ1菌株的培养特征及石炭酸复红染液染色后显微镜下形态观察，借助《真菌鉴定手册》[11]及《中国真菌志》[12]，初步鉴定该菌为丛梗孢科某真菌。

X1菌落在麦芽汁琼脂培养基上28 ℃培养3 d即形成较典型的菌落，菌落呈白色、蛛网状，无隔。分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚状枝为双轮生或三轮生，梗基每轮2～3个，瓶梗每轮4～8个，分生孢子为椭圆形，壁平滑，分生孢子链圆柱状。根据X1菌株的培养特征及乳酸石炭酸棉蓝染液染色后显微镜下形态观察，借助《真菌鉴定手册》[11]及《中国真菌志》[12]，初步鉴定该菌为丛梗孢科某真菌。

2.2.2  进化树构建

通过16sRNA-ITS测序，将3株优势菌株XY6、XJ1、X1的16S rDNA核酸序列输入NCBI Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），与已知的菌株序列进行比对，分析其亲缘和进化关系，并用MEGA5.1软件绘制菌株的系统进化树，结果见图3～图6。结果表明，XJ1与链格孢菌Alternaria sp.的16S rDNA序列有99%的同源性，XY6与链格孢菌Alternaria sp.的16S rDNA序列有93%，X1菌株与好食链孢霉菌Neurospora africana的16S rDNA序列有99%的同源性。结合形态学及分子生物学染色结果综合分析，将XJ1与XY6菌株均归属于链格孢菌属Alternaria sp.，X1与好食链孢霉菌Neurospora africana具有较近的遗传距离。

3  讨论

内生真菌指长期生活在植物根、茎、叶等器官的组织内部，但一般不引发植物体病害的真菌[13-14]。本试验从健康生长的铁皮石斛植株根、茎和叶中分离得到7株内生真菌，并对其中3株具有代表性的菌株进行形态学分析，在此基础上进一步通过16sRNA-ITS测序和比对，得到X1、XJ1和XY6菌株同为链格孢菌属，其中X1为链孢霉属中的好食链孢霉菌种。链格孢菌属为真菌界半知菌纲链孢霉目黑霉科，广泛分布于自然界土壤及禾本植物。大多数此类菌种兼性寄生在植物上，少数几个链格孢小孢子种可侵染人和动物。此外，链格孢菌是一种具有应用潜力的生物资源，如长柄链格孢某些菌株分生孢子壁中含有激发子组份，可被用来制成防治烟草赤星病的生防制剂等[15]。研究发现，链孢霉菌丝体中含有丰富的蛋白质、糖分、淀粉、酶及多种维生素乙等营养成分，这种霉菌在饲料中大量繁殖，可提高饲料的营养价值，使粗饲料成为精饲料[16]。本研究还发现，X1内生真菌可产生橙红色色素，我们将对其稳定性及相关抑菌活性进行研究[17-18]。研究发现，某些细菌、真菌等微生物产生的色素可以作为天然染料用于纺织品的染色，可选择能够大量生产色素的真菌作为新型的天然染料应用于纺织品染色，利用真菌培养的优势对色素进行工业化生产[19-21]。本研究可为铁皮石斛内生真菌的生物活性物质筛选和铁皮石斛资源开发提供依据。

参考文献：

[1] 冯永君.植物内生细菌[J].自然杂志，2001，5（23）：249-252.

[2] ANDREWS J H. Biological control in the phylloshere[J]. Annu Rev Phytopathol，1992，30：603-635.

[3] 胡克興，侯晓强，郭顺星.铁皮石斛内生真菌分布[J].微生物学通报， 2010，37（1）：37-42.

[4] 龚莺，何伯伟，王淑珍，等.铁皮石斛内生菌研究进展[J].浙江农业科学，2017，58（8）：1372-1375.

[5] 王伟英，李海明，邹晖，等.铁皮石斛促生内生真菌的功能研究进展[J].中国园艺文摘，2016，32（11）：52-53.

[6] 杨鹤同.铁皮石斛内生菌根真菌的筛选及其作用机理研究[D].南京：南京农业大学，2015.

[7] 马昭，唐承晨，张纯，等.内生菌与宿主植物关系对中药材道地性研究的启示[J].上海中医药大学学报，2015，29（6）：4-11.

[8] 严亮，杨瑞娟，王桥美.云南铁皮石斛内生菌的分离与鉴定[J].云南农业大学学报（自然科学），2015，30（5）：760-765.

[9] 黎勇，罗培凤，朱丹丽，等.金钗石斛菌根、茎和叶内生真菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学，2012，40（23）：11598-11600.

[10] 俞婕，赵凯鹏，董飞，等.野生铁皮石斛内生菌的分离及促生作用研究[J].现代农业科技，2010（9）：96-97.

[11] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：9.

[12] 中国科学院中国孢子植物志编辑委员会.中国真菌志[M].北京：科学出版社，2018：52.

[13] 易晓华，王智辉，胡林峰，等.除蟲菊内生真菌的分离及其发酵产物抑菌活性筛选[J].西北植物学报，2008，28（2）：2317-2323.

[14] 王静，易晓华，魏艳，等.11株侧柏内生真菌的农药活性及分子生物学鉴定[J].中国农学通报，2013，29（15）：183-187.

[15] 王洪凯，张天宇，张猛.链格孢属真菌分类研究进展[J].山东农业大学学报，2001，32（3）：406-410.

[16] 周少培.链孢霉菌丝饲料的土法制造及喂猪试验[J].上海畜牧兽医通讯，1960（2）：54-55.

[17] 周琢艳，刘玉寒，刘文洪，等.铁皮石斛内生真菌的分离及其体外抑菌和抗肿瘤活性初步研究[J].中草药，2017，48（3）：533-538.

[18] 李俊峰，刘文洪，张贝贝，等.铁皮石斛内生菌的分离及代谢产物活性的初步研究[J].中华中医药杂志，2016，31（3）：970-974.

[19] 李红艳.真菌色素的制备及其对蛋白质纤维织物的染色研究[D].杭州：浙江理工大学，2015.

[20] 刘章武，胡中泽.一株丝状真菌产生的红色素的研究[J].中国商办工业，2001（10）：45-46.

[21] 张志华，康应田.海洋丝状真菌生物活性物质的研究概述[J].安徽农学通报，2010，16（11）：73-76.

（收稿日期：2018-10-13）

（修回日期：2019-04-10;编辑：陈静）