重组人干扰素a2b联合顺铂对骨肉瘤的作用及其对VEGF表达的影响

阮湘虹, 王艳, 杜娟, 陈玉华, 李利

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤,主要发生在儿童和青少年期[1-2]。骨肉瘤的病因尚不明确,可能与环境和遗传因素有关[3]。近年来，随着手术治疗、放射治疗和辅助化疗技术的进展,使诊断时未转移患者的5年生存率达60%～70%[4]。然而,转移性或复发性骨肉瘤患者的生存结果极差[5]。辅助化疗如顺铂、多柔比星和甲氨蝶呤常用于治疗骨肉瘤[6]。而化疗相关的问题,包括严重的不良反应仍然存在。因此迫切需要寻找骨肉瘤的新治疗方法。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是由刺激血管生成细胞产生的信号蛋白,是一种血管内皮调节因子[6-7]。重组人干扰素a作为最有潜力的广谱抗病毒药物之一,其通过与靶细胞表面干扰素受体结合,诱导靶细胞内2-5(A)合成酶、蛋白激酶PKR、MX蛋白等多种抗病毒蛋白生成,阻止病毒蛋白质合成、抑制病毒核酸的复制和转录,最终实现抗肿瘤血管生成的目的[8]。研究发现,重组人干扰素与化疗联合可能在治疗病毒感染方面具有协同作用[9],但目前关于干扰素联合化疗治疗骨肉瘤的研究尚少。本研究通过分析重组人干扰素a2b与顺铂联合应用对骨肉瘤中VEGF表达水平的影响,并进一步探讨其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人骨肉瘤细胞株(中国科学院细胞生物学研究所);干扰素a2b冻干粉(西安华奥丽康生物工程有限公司);顺铂注射液(齐鲁制药厂);ELISA检测试剂盒(北京天之泰生物科技有限公司);鼠抗人CD34(Santa Cruz,美国);TUNEL试剂盒(罗氏,美国);酶标仪(Thermo Labsystem,芬兰)。

1.2 实验动物及细胞 32只4～6周龄雌性裸鼠,体重20～25 g,清洁级。饲养于南方医科大学南方医院惠侨医疗中心。动物实验得到南方医科大学南方医院惠侨医疗中心动物伦理协会的批准,按照国家动物实验要求规则,在实验过程中尽最大可能善待动物,减少动物的痛苦。实验裸鼠在温度(25±1)℃和50%的湿度下饲养4周,正常进食进水。

培养人骨肉瘤细胞至对数生长期,经胰酶消化后PBS洗涤2次,离心,弃上清,加入生理盐水制成单细胞悬液,细胞浓度为5×106/ml。将细胞悬液接种于裸鼠背部皮下,肿瘤直径生长至0.5 cm为成瘤。

1.3 动物分组与处理 将100万单位的干扰素a2b冻干粉溶于100 ml生理盐水,配制浓度为1×105IU/ml,4 ℃冷藏备用。将顺铂注射液浓度配至0.2 g/L,20 ℃避光保存。

将荷瘤裸鼠分为4组,每组8只:对照组,皮下注射生理盐水0.1 ml,每天1次;干扰素a2b组,瘤旁皮下注射干扰素a2b 0.1 ml,每天1次;顺铂组,腹腔注射顺铂溶液0.2 ml,每天1次;联合治疗组,瘤旁皮下注射干扰素a2b 0.1 ml,同时腹腔注射顺铂0.2 ml,1周2次。观察肿瘤生长30 d,记录各组移植瘤结节出现时间及生长情况,计算肿瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线。30 d后处死裸鼠,取瘤体称重。福尔马林固定,石蜡包埋,切片,进行免疫组化染色观察。

1.4 CD34标记阳性微血管密度(MVD)计数 采用免疫组化法进行CD34标记,用Weidner方法计数MVD:先用低倍镜观察整张切片,寻找肿瘤组织内MVD最高的3个热点区,在200倍镜下拍照,计数每一张照片的微血管数目,3张照片中微血管数目的平均数即代表本张切片的阳性脉管数。任何被CD34标记成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇可作为一个计数单位,不以是否形成管腔或管腔内有无红细胞为计数依据,管腔直径大于8个红细胞直径或有肌层的血管不计数。分别计数5个视野,取其平均值作为该肿瘤组织的MVD值。

1.5 显微镜下检测细胞凋亡情况 凋亡阳性细胞细胞核呈黄褐色、核质浓缩、细胞形态不规则,阴性则无细胞形态学变化、不着色或仅轻微染色。镜下观察,选取5个高倍视野,每个视野200个细胞,计数1 000个细胞,肿瘤细胞凋亡指数(apoptotic index,AI)=凋亡阳性细胞数/总细胞计数×100%。

1.6 ELISA法检测VEGF水平 分别将样品稀释液加入空白孔、标准品或待测样品孔。覆膜，37 ℃温育2 h。弃液甩干，各孔加100 μl氢供体DH2，酶标板覆膜，37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，浸泡1～2 min，甩干。各孔加入显色剂100 μl，覆膜，37 ℃温育1 h。洗板4次。各孔加入显色剂100 μl，避光。室温下孵箱孵育15 min。每孔加终止液100 μl，混匀后用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，并据此绘制曲线计算出样品浓度，通过标准曲线计算出VEGF蛋白阳性率。

2 结果

2.1 4组成瘤裸鼠的皮下肿瘤生长曲线 4组裸鼠成瘤率均为100%。顺铂组和对照组各时点的肿瘤体积差异均无统计学意义(均P>0.05);联合治疗组在10 d以后的肿瘤体积显著低于顺铂组和对照组(均P<0.05)。接种后30 d处死裸鼠称其移植瘤重量,联合治疗组的瘤体重量显著低于顺铂组和对照组[(0.733±0.054)gvs.(2.326±0.151)g、(2.419±0.166)g],差异有统计学意义(均P<0.05),而干扰素a2b组(2.286±0.024 g)和对照组间瘤体重量差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

图1 4组裸鼠植瘤后不同时间的肿瘤生长体积比较

2.2 4组裸鼠肿瘤组织的MVD比较 联合治疗组的MVD值低于顺铂组和对照组,顺铂组低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);干扰素a2b组与对照组差异无统计学意义,见表1。

2.3 骨肉瘤细胞凋亡情况比较 联合治疗组移植瘤的凋亡指数高于顺铂组和对照组,顺铂组高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);干扰素a2b组和对照组差异无统计学意义,见表1。

2.4 VEGF蛋白在裸鼠骨肉瘤组织中的表达 免疫组化染色见移植瘤组织中的VEGF呈棕黄色表达,主要定位于细胞浆内和(或)胞膜(图2)。干扰素a2b组和联合治疗组的VEGF蛋白阳性率低于顺铂组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),顺铂组和对照组差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

组别MVD值凋亡指数(%)VEGF蛋白阳性率(%) 对照组31.8±3.129.66±1.1568.37 干扰素a2b组32.1±3.2510.00±1.2820.62ab 顺铂组27.45±1.64a21.46±2.32a59.24 联合治疗组22.86±2.86ab45.62±4.24ab15.45abF值6.2434.865P值0.0310.015

注：a与对照组比较,P<0.05;b与顺铂组比较,P<0.05

3 讨论

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的高度血管化肿瘤,是一种常见的骨科恶性肿瘤,其血行转移发生率高,易复发转移[10]。骨肉瘤的主要发生机制是成骨细胞的非正常增殖,骨生长过快,转录因子、生长因子、抑癌基因、染色体异常和miRNAs等均与骨肉瘤的发生发展有关[11]。骨肉瘤多发于青少年,具有早期转移和侵袭能力强的特点,行辅助化疗保肢术后5年存活率在70%左右[12]。对骨肉瘤的早期诊断和治疗多采用药物化疗等方式,至今仍缺乏有效的治疗措施,因此,探寻有效的诊断方法和治疗途径已成为现阶段骨肉瘤研究的热点。

图2 4组移植瘤免疫组化染色图(×400)

VEGF是重要的可提示肿瘤代谢及转移的标志物,其主要生物学功能包括:增加血管通透性、促进血管形成,为肿瘤浸润及转移提供条件[13]。血管生成和细胞凋亡是肿瘤细胞两种公认的特性,针对血管生成抑制和凋亡诱导的抗癌治疗是有前途的治疗策略。抑制血管生成分子/途径导致肿瘤因缺乏血液供应和营养而饿死;诱导细胞凋亡,并控制肿瘤细胞数量[14-16]。

干扰素是一组具有抗血管生成、直接抗肿瘤和免疫刺激性质的细胞因子。EURAMOS 1临床试验将干扰素a2b作为手术的单一佐剂治疗骨肉瘤,结果显示患者生存率明显增加[17]。本研究通过皮下注射重组人干扰素a2b联合顺铂治疗骨肉瘤荷瘤裸鼠,结果发现,注射重组人干扰素a2b联合顺铂的裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量均低于对照组及顺铂组,提示重组人干扰素a2b联合顺铂治疗可导致肿瘤生长受到明显抑制。有研究报道干扰素a2b可通过抑制促血管生成物质VEGF的分泌在晚期恶性肿瘤中发挥抗肿瘤作用[18]。

本研究通过免疫组化研究干扰素a2b对骨肉瘤组织中VEGF水平的影响,结果显示重组人干扰素a2b联合顺铂可显著抑制裸鼠体内VEGF蛋白表达水平,且联合治疗使裸鼠肿瘤生长缓慢,MVD值降低,凋亡指数升高,进一步证实联合注射在骨肉瘤中的抗肿瘤作用。据此笔者推测:肿瘤内MVD降低和凋亡指数增高可能是肿瘤血管生成抑制和凋亡诱导的共同作用,进一步证实重组人干扰素a2b联合顺铂在骨肉瘤中的抗肿瘤作用。

综上所述,重组人干扰素a2b联合顺铂能特异性抑制骨肉瘤裸鼠VEGF的表达、血管生成和肿瘤生长,并能促进肿瘤细胞凋亡。因此,重组人干扰素a2b联合顺铂有可能成为治疗骨肉瘤的一种新方法。