酵母菌-植物乳杆菌复合发酵菠萝酵素生物活性的初步研究

赵治巧，曾莉，万玉军，王刚，唐自钟*，布同良，陈惠，罗丽娟

1(四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安,625014)2(四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都,611130)

菠萝，又称凤梨，为四大热带名果之一[1]，富含Vc、碳水化合物和有机酸(主要为奎宁酸、马来酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸等)等成分[2]，具有健胃消食、治疗咽炎和促进血液循环[3]的作用。它作为一种季节性强的水果，很难长期保存[4]，除可供鲜食之外，对其进行加工也是亟待解决的一个问题。

果蔬酵素是植物综合酵素的一种，以一种或多种新鲜水果、蔬菜、蘑菇等纯天然植物为原料[5]，经微生物发酵产生的富含酚类、有机酸、氨基酸、黄酮类等营养成分[6-7]和具有抗氧化、解酒护肝、改善肠胃状况、净化血液和润肠通便[8-9]以及其他功效的新型产品。其主要酶类有脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)[10]。在食品发酵中，酵母菌、乳酸菌和醋酸菌是常用的发酵菌种[11]。果蔬经微生物作用后，在原有营养功能的基础上还会带来别的功效[12]。目前，关于果蔬酵素，很多学者致力于它的抗氧化研究。李凡等[13]通过复合发酵获得白首乌酵素对超氧阴离子自由基和羟基自由基具有较强的清除能力；樊秋元等[14]研究发现接种发酵的黑加仑酵素抗氧化能力比自然发酵的抗氧化能力强；此结果与人参酵素抗氧化活性研究结果一致[15]。菠萝酵素为菠萝经酵母菌和植物乳杆菌复合发酵后获得的发酵液，国内外对其研究报告较为少见。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和果酒酵母(fruit wine yeast)，四川省食品发酵工业研究设计院；菠萝，市售；福林酚试剂、3,5-二硝基水杨酸、苯酚，北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化试剂盒、α-淀粉酶试剂盒、总超氧化物歧化酶试剂盒，南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-25数显pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DK-8D电热恒温水槽，上海三发科学仪器有限公司；XZ18K-T高速冷冻离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；Multiskan Sky酶标仪，上海合商科学仪器有限公司；其他均为实验室常规仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 菠萝酵素的制作

制作工艺：选取新鲜菠萝→去皮→切块→装瓶→加入酵母菌→补糖→加入乳酸菌→后熟→停止发酵→得发酵液。

1.3.2 样品预处理

取发酵6个月的菠萝酵素，经8 000 r/min离心20 min，取上清液作为试验样品备用。

1.3.3 菠萝酵素化学成分含量的测定

总糖含量,参考文献[5,16];总黄酮含量,参考文献[17];总酚含量,参考文献[5,18],蛋白质含量,参考文献[5,19]。

1.3.4 功效酶活力测定

样品处理：样品经过20 min细胞破碎处理(破碎5 s、间歇5 s)，再低温离心(8 000 r/min，15 min)，取上清液进行酶活力测定。

T-SOD活力测定，根据总超氧化物歧化酶活力测定试剂盒说明书进行;蛋白酶活力测定，参考文献[16]；淀粉酶活力测定，采用碘-淀粉比色法测定(试剂盒)；脂肪酶活力测定，参考文献[20]。

1.3.5 抗氧化能力测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

参考文献[21]，准确配制0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用蒸馏水稀释样品成不同体积分数(4%～28%)的待测样。在酶标板上，加入100 μL DPPH溶液和100 μL梯度样品溶液，混匀，室温避光静置30 min，于λ=517 nm处测OD值。以无水乙醇作为空白对照，Vc(0.01～0.07 mg/mL)为阳性对照。按公式(1)计算清除率：

(1)

式中：A1，样品管吸光度；A2，样品本底管的吸光度；A0，空白对照管的吸光度。

1.3.5.2 ·OH清除能力

参考文献[21-22]，将样品稀释成不同体积分数(8%～56%)的待测样。取50 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 6 mmol/L H2O2溶液，200 μL酵素溶液，摇匀，静止10 min，再加入50 μL 6 mmol/L水杨酸溶液，50 μL体积分数70%乙醇，摇匀，37 ℃反应30 min。于λ=510 nm处测OD值。用体积分数70%乙醇调零,Vc(0.01～0.07 mg/mL)为阳性对照。按公式(2)计算清除率：

(2)

式中：A1，样品管吸光度；A2，样品本底管吸光度；A0，空白对照管的吸光度。

将样品稀释成不同体积分数(10%～70%)的待测样,取0.5 mL样品溶液与1.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)混合，25 ℃水浴20 min，然后加入0.2 mL 25 mmol/L的邻苯三酚，反应4 min，取浓盐酸0.25 mL终止反应。于λ=325 nm处测OD值，记作Ak；以溶剂代替样品，同样条件反应测Aj，蒸馏水调零。Vc(0.1～0.7 mg/mL)为阳性对照。按公式(3)计算清除率：

(3)

式中：Ak，样品管吸光度；Aj，空白对照管的吸光度。

1.3.5.4 总抗氧化能力

根据总抗氧化能力试剂盒说明书测定。

2 结果与分析

2.1 菠萝酵素成分含量

菠萝酵素化学成分如表1所示，4种化学成分中总糖含量最高，总酚次之，总黄酮的含量最低。在果蔬酵素中，糖含量的高低会影响酵素的口感和风味，是检验酵素优劣的指标之一[24]。乳酸菌和酵母菌作为常用发酵菌种，在糖代谢过程中扮演着重要的角色。在发酵前期，乳酸菌利用果实自身的糖和外源糖进行生理代谢活动，随着酵母菌的添加，两者共同的代谢活动使得整个发酵体系糖含量降低。经乳酸菌和酵母菌复合发酵4个月后获得的核桃青皮酵素总糖，总酚，黄酮和蛋白质含量均比菠萝酵素高[25]。后者发酵时间比前者长，这可能是造成总糖含量差异的原因之一。BRAVO等[26]研究表明总酚作为一种抗氧化剂，通过快速向自由基提供氢原子来干扰脂质和其他分子的氧化，从而达到清除自由基的目的，其中的黄酮类因特殊的化学结构而具有抗氧化能力。随着发酵的进行，总酚含量也会发生变化，CHU等[27]研究发现，在发酵过程中，大分子酚类物质经微生物降解生成小分子酚类物质，使得总酚含量增加。而蛋白质含量的变化与微生物降解也有关系[28]。

表1 菠萝酵素化学成分分析结果

2.2 功效酶活力

2.3 抗氧化能力

DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，在517 nm处有强吸收峰，通常被用来检测物质的抗氧化性。IC50指自由基清除率为50%时对应的样品浓度[33]，该值与物质的抗氧化能力呈反比关系。

表2 菠萝酵素与其他酵素酶活性分析 单位：U/mL

注：“-”表示该文献中未见报道

图1和图2分别为不同浓度的Vc和菠萝酵素对DPPH自由基的清除能力。在实验浓度范围内，Vc对DPPH自由基清除率从45.61%上升到99.37%，菠萝酵素对DPPH自由基清除率从36.04%上升到78.06%。经计算得，菠萝酵素对DPPH自由基的IC50为7.30%。以Vc为阳性对照时，其半抑制量为0.011 mg Vc当量/mL。CHU等[27]研究表明，发酵物质对自由基清除率表现出差异受原料、微生物和发酵液代谢产物的影响。

图1 不同浓度的Vc对DPPH自由基清除能力

图2 不同浓度的菠萝酵素对DPPH自由基清除能力

图3和图4分别为不同浓度的Vc和菠萝酵素对·OH的清除能力。实验浓度范围内，Vc对·OH清除率从31.63%上升到51.14%，菠萝酵素对·OH清除率从28.81%上升到63.21%。经计算得，菠萝酵素对·OH的IC50为29.30%。以Vc为阳性对照时，其半抑制量为0.070 mg Vc当量/mL。CLAUDINE等[34]研究表明，黄酮类化合物对·OH有较好的清除能力，其清除能力的强弱取决于芳香环上羟基的数目和位置[35]。

图3 不同浓度的Vc对·OH清除能力

图4 不同浓度的菠萝酵素对·OH清除能力

图5 不同浓度的Vc对清除能力

图6 不同浓度的菠萝酵素对清除能力

菠萝酵素的总抗氧化能力为(31.62±1.73)U/mL。JAYAPRAKASHA等[37]研究发现，酚类、类胡萝卜素和黄酮类等化合物的协同作用可以提高物质的总抗氧化活性。另外，物质中的化学成分和酚酸含量与总抗氧化能力也有关系[35]。

在体外抗氧化能力实验中发现，菠萝酵素的抗氧化活性较好。这可能是因为，在发酵过程中，菠萝本身含有抗氧化成分，如Vc等[2],另外，所选发酵菌种自身就具有很好的抗氧化能力[38]。除此之外，发酵过程中微生物使原料中的功能成分进行转化和利用[27,38]，多种功能成分的协同作用使其总抗氧化活性增强[37]，但其具体的生理作用仍需进一步的研究。

3 结论