三七总皂苷结合针灸干预对急性缺血性脑卒中大鼠血脑屏障的保护作用及对PI3K/Akt信号通路的影响∗

刘 禹 邵海宇 王 琦

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔 161005）

脑卒中是由于脑部血管发生破裂或阻塞，导致血液不能进入大脑相应组织，引起脑组织缺血缺氧而导致的一类脑部疾病［1］。脑卒中是全球范围内第二大致死性原因，同时也是引起残疾的主要原因之一，具有高发病率、高死亡率、高致残率以及高复发率的特点，成为一项全球性的公共卫生问题［2-3］。目前针对急性缺血性脑卒中临床治疗方式主要包括药物治疗（溶栓药物、神经保护剂）以及手术治疗（机械血栓去除术），然而由于治疗时间窗狭窄、临床副作用大以及并发症风险高等原因，使其在临床中的应用屡遭瓶颈［4］。三七总皂苷（PNS）是五加科植物三七的一种主要有效活性成分，含有多种单体皂苷。药理学相关研究显示［5-6］，三七总皂苷具有扩张血管、抑制血小板凝集、降低心肌耗氧量、降血脂、清除氧自由基以及抗炎、抗氧化等相关作用；此外，有学者研究证实［7］，在急性缺血性脑卒中患者中使用三七总皂苷与阿替普酶溶栓治疗，可降低患者溶栓过程中的出血性转化风险，而关于三七总皂苷对血脑屏障保护作用及其机制目前仍未阐明。针灸治疗缺血性脑卒中患者已经取得了良好的临床疗效，且学者认为在脑卒中后偏瘫治疗中早期针刺治疗，可促进肢体功能的康复，改善患者临床预后［8-9］。本研究探讨分析PNS结合针灸治疗急性缺血性脑卒中大鼠血脑屏障保护作用及对大鼠PI3K/Akt信号通路的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体质量250～300 g，购于中国医学科学院实验动物研究所，实验动物许可证：SCXK（京）2005-0013。温度20～25℃，湿度40%～50%，自由饮食、水。

1.2 试药与仪器

PNS（昆药集团股份有限公司），使用0.9%氯化钠注射液配制为质量浓度1 mg/mL的溶液备用；伊文思蓝（EB）（美国Sigma公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；maker预染蛋白（美国Thermo公司）；HRP辣根过氧化物酶标记二抗（北京中杉金桥公司）；兔抗鼠PI3K单克隆抗体（美国Abcam公司）；兔抗鼠Akt单克隆抗体（美国Abcam公司）；ECL发光试剂盒（美国Pierce公司）；G6805型电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；一次性针灸针（苏州华佗牌，直径0.2mm，针身长0.5寸）；多功能酶标仪（美国BioTek公司）。

1.3 造模及分组

将大鼠随机分为4组，分别是假手术组、模型组、针灸组、PNS+针灸组，每组各15只。采用Zea Longa线栓法［10］制作大鼠缺血性脑卒中模型，使用4%恩氟烷诱导麻醉，1%～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2维持麻醉，术中小心分离大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉，使拴线从大鼠颈外动脉残端插入颈内动脉，直至距颈外动脉与颈内动脉分叉处1.8 cm处停止。线栓停留1.5 h后拔除栓子，制备缺血/再灌注损伤模型。假手术组大鼠仅分离上述血管，而不插入栓线。缺血1.5 h后拔除线栓，将大鼠尾部提起，可见大鼠左侧前肢屈曲则视为造模成功。采用差额补充法保证每组实验大鼠的例数。

1.4 干预方法

1）针灸组：造模成功后将不予麻醉的大鼠固定在鼠夹上，根据华兴邦等制定的大鼠针灸穴位进行定位，选取百会、水沟、双侧内关以及双侧三阴交。采用捻转、提插补泻刺激双侧内关1 mm，强刺激1 min，留针30 min；采用雀啄法有鼻中隔下部向上斜刺水沟1 mm，强刺激1 min；然后再应用提插法直刺三阴交5 mm，持续1 min，留针30 min；最后针刺百会穴，取向后斜刺2 mm，采用平补平泻捻转法刺激1 min，留针30 min。留针期间，使用G6085电针治疗仪连接内关与三阴交穴位针柄，调整电压2～4 V，给予疏密波，刺激强度以针刺部位轻微抖动。第1次针刺在造模成功后24 h内进行，以后每天固定时间针刺1次，7 d为1个疗程。2）PNS+针灸组：术前10 min给予PNS 10 mg/kg尾静脉注射，术后24 h内开始针灸治疗，治疗方法同针灸组，持续治疗14 d，每次针灸治疗完成后30 min，给予PNS 10 mg/kg尾静脉注射。3）假手术组与模型组：抓取、固定方法同针灸组，但不进行针刺。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 大鼠行为学评分比较 分别于术后24 h、术后3 d、术后7 d对各组大鼠进行神经行为学评分。0分：大鼠无神经缺损症状。1分：提起大鼠尾部后，左侧前爪不能完全伸展。2分：爬行时大鼠向左侧转圈。3分：大鼠行走困难且向左侧倾倒。4分：大鼠无法自发行走且意识丧失。

1.5.2 血脑屏障通透性 各组大鼠完成治疗后，每组5只大鼠测定血脑屏障通透性。经微静脉注射EB 4 mL/kg，使其在体内循环2 h后，麻醉，经左心室灌注0.9%氯化钠注射液300 mL，取各组大鼠大脑左右半球进行称量，加入2 mL甲酰胺匀浆后置于54℃条件下温育2 h，离心20 min（12 000 g）。采用紫外分光光度计检测620 nm波长处的吸光度，使用EB标准曲线浓度计算各组大鼠脑组织中EB含量。

1.5.3 脑组织含水量测定 各组大鼠完成治疗后，每组5只大鼠测定脑组织含水量，取大鼠大脑左右半球称质量，120℃烤箱烘烤12 h，测量大脑干湿重比，干湿重比=（湿重-干重/湿重）×100%。

1.5.4 Wesren blotting法检测大鼠脑组织PI3K、Akt蛋白表达 各组大鼠完成治疗后，每组使用5只大鼠测定脑组织PI3K、Akt蛋白表达，取大鼠右侧大脑组织用于目的蛋白的表达检测，用冰0.9%氯化钠注射液漂洗脑组织清除血液后拭干。取100 mg脑组织，加入细胞裂解液匀浆。离心后取上清，采用BCA蛋白分析法测定蛋白浓度，然后使用悬浮缓冲液调整蛋白浓度。加入等体积加样缓冲液后混合均匀，水浴煮沸5 min。取含20 μg蛋白的样品上样进行SDS-PAGE电泳分离，然后电转印到PVDF膜上。加入5%脱脂奶粉封闭液37℃封闭1 h，将PVDF膜置于杂交袋内，加入适当稀释后的一抗封闭液，4℃下孵育过夜；PBST漂洗PVDF膜后，常温二抗孵育1 h，再次漂洗。将ECL液滴于PVDF膜上作用1 min，置于X线片盒中，曝光2～5 min显影、定影、水洗、晾干。将X线片使用扫描仪扫描，并应用Quantity One软件对各组光密度值进行分析。将目标蛋白光密度值与β-actin光密度值的比值作为目标蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评分比较

见表1。术后24 h、术后3 d、术后7 d各脑卒中组大鼠神经行为学评分显著高于假手术组（P＜0.05），术后24 h各脑卒中组大鼠神经行为学评分相当（P＞0.05），而术后3 d、术后7 d针灸组、PNS+针灸组大鼠神经行为学评分较模型组显著降低（P＜0.05），且PNS+针灸组大鼠神经行为学评分显著低于针灸组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠行为学评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠行为学评分比较（分，±s）

与假手术组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与针灸组比较，△P＜0.05。下同

组别假手术组模型组针灸组PNS+针灸组n 15 15 15 15术后24 h 0.00±0.00 3.02±0.35*2.97±0.43*3.08±0.39*术后3 d 0.00±0.00 2.91±0.24*2.62±0.27*#2.41±0.19*#△术后7 d 0.00±0.00 2.77±0.41*2.30±0.33*#2.07±0.25*#△

2.2 各组大鼠血脑屏障通透性比较

见表2。各组大鼠左脑组织EB含量相当（P＞0.05），各脑卒中组大鼠右脑组织EB含量显著高于假手术组（P＜0.05），其中针灸组与PNS+针灸组大鼠右脑组织EB含量较模型组显著降低（P＜0.05），而PNS+针灸组大鼠右脑组织EB含量显著低于针灸组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脑组织EB含量比较（mg/g，±s）

表2 各组大鼠脑组织EB含量比较（mg/g，±s）

组别假手术组模型组针灸组PNS+针灸组n 5 5 5 5 EB含量（左脑）8.12±2.03 8.42±1.97 8.31±2.14 8.36±2.08 EB含量（右脑）8.35±2.10 25.63±4.11*19.89±4.52*#16.70±3.96*#△

2.3 各组大鼠脑组织含水量比较

见表3。各组大鼠左脑组织含水量相当（P＞0.05），各脑卒中组大鼠右脑组织含水量显著高于假手术组（P＜0.05），其中针灸组与PNS+针灸组大鼠右脑组织含水量较模型组显著降低（P＜0.05），而PNS+针灸组大鼠右脑组织含水量显著低于针灸组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠脑组织含水量比较（%，±s）

表3 各组大鼠脑组织含水量比较（%，±s）

组别假手术组模型组针灸组PNS+针灸组n 5 5 5 5含水量（左脑）77.95±0.92 78.12±1.21 78.01±1.68 78.42±1.83含水量（右脑）78.32±1.02 85.64±1.17*#83.08±0.95*#80.22±0.99*#△

2.4 各组大鼠脑组织PI3K、Akt蛋白表达比较

见表4，图1。各脑卒中组大鼠脑组织PI3K、Akt表达水平均较假手术组显著升高（P＜0.05），其中针灸组以及PNS+针灸组大鼠脑组织PI3K较模型组显著升高（P＜0.05），且PNS+针灸组大鼠脑组织PI3K表达显著高于针灸组（P＜0.05）；而模型组、针灸组以及PNS+针灸组大鼠脑组织Akt表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠脑组织PI3K、Akt蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织PI3K、Akt蛋白相对表达量比较（±s）

组别假手术组模型组针灸组PNS+针灸组n 5 5 5 5 PI3K 0.513±0.042 0.683±0.029*0.819±0.031*#1.281±0.045*#△Akt 1.123±0.061 1.204±0.042*1.191±0.054*1.218±0.048*

图1 各组大鼠脑组织PI3K、Akt蛋白表达

3 讨论

缺血性脑卒中属于中医学“中风”范畴，其病机多为阴阳失调、血气运行受阻、血瘀滞络等［11］。针灸治疗，包括头皮针以及电针等治疗，由于其具有简便、经济且疗效确切的临床优点，被广泛用于临床脑卒中患者康复过程，本研究采取“醒脑开窍”针刺法进行动物方面研究验证［12-13］。

关于PNS治疗脑血管病方面神经保护机制，目前已经有相关研究报道［14-15］，其中主要集中在PNS抗氧化、抗血管损伤以及抗血小板聚集方面，而关于PNS对血脑屏障的影响及其机制，尚无相关报道。此外，药物联合针灸治疗缺血性脑卒中一直是临床关注的焦点，以更好地提高患者临床疗效、降低患者残疾率以及病死率，以改善患者临床预后［16］。本研究从实验动物入手，探讨分析PNS结合针灸治疗急性缺血性脑卒中大鼠血脑屏障保护作用及对PI3K/Akt信号通路的影响。

本研究结果显示，术后3 d、术后7 d针灸组以及PNS+针灸组大鼠神经行为学评分较模型组显著降低，同时PNS+针灸组大鼠神经行为学评分显著低于针灸组。结果提示采取针灸、联合三七总皂苷治疗后，可有效改善大鼠脑卒中后神经行为学，与临床相关报道相似［17］。药物联合针灸治疗是脑卒中患者早期康复的重要措施之一，有助于患者治疗后肢体功能的恢复，降低患者致残率。各脑卒中组大鼠右脑组织EB含量以及脑组织含水量均较假手术组显著升高，而针灸组以及PNS+针灸组大鼠右脑组织EB含量以及脑组织含水量较模型组有所降低，其中PNS+针灸组大鼠显著低于针灸组。血脑屏障是分割血液与大脑的一种复杂屏障系统，在脑缺血后，可引发血管内皮损伤，细胞外基质破坏，从而引起血脑屏障完整性的破坏，导致血脑屏障通透性增加且发生血源性脑水肿［18］。从本研究来看，缺血性脑卒中模型制作后，可提高大鼠血脑屏障通透性同时增加脑组织含水量，进一步证实脑卒中对血脑屏障的破坏作用。此外，采取针灸治疗或联合PNS治疗均可有效降低大鼠血脑屏障通透性同时降低脑水肿程度，发挥血脑屏障保护作用，其中PNS联合针灸治疗对脑卒中大鼠血脑屏障的保护作用更佳。

PI3K/Akt信号通路是脑缺血和神经系统凋亡转导的重要通路之一。研究显示，大多数神经营养因子均可激活PI3K/Akt信号通路，对神经凋亡产生抑制作用，发挥神经保护、减轻血源性脑水肿的发生［19-20］。国外学者对大鼠进行缺血预处理［21］，结果显示，缺血预处理可延长脑缺血发生后PI3K/Akt信号活化持续时间，从而在脑缺血耐受中发挥着重要作用。本研究中，各脑卒中大鼠PI3K、Akt蛋白表达量均较假手术组显著升高，针灸组、PNS+针灸组大鼠PI3K蛋白表达量较模型组明显升高，其中PNS+针灸组大鼠升高程度更为明显；而针灸组、PNS+针灸组大鼠与模型组比较，Akt蛋白表达量无明显变化。提示脑卒中发生后，可导致脑组织PI3K/Akt信号通路的激活，这可能是机体神经保护代偿性作用之一，而有效的治疗可进一步促进该通路的激活程度，以进一步发挥神经保护作用。而关于治疗后Akt蛋白表达与模型组无差异，可能由于实验样本量较小或脑卒中后检验时间较长等因素有关。

综上所述，PNS联合针灸治疗急性缺血性脑卒中大鼠具有显著的血脑屏障保护作用，可有效改善大鼠神经行为学状况，其作用机制可能与促进PI3K/Akt信号通路的激活有关。