常用微生物培养有机质对小球藻生长的影响

金卫华，骆淑媛，丁奕丹，郭露寒，张 贇，唐红枫，孙 茜

(1.武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212；2.武汉东湖学院 生物医用材料创新研究所，湖北 武汉 430212；3.湖北省疾病预防控制中心，湖北 武汉 430079)

小球藻营养丰富，含有蛋白质、核酸、糖类、脂类和微量元素等多种生物活性物质，具有显著增强免疫、抗癌、抗病毒等作用[1-2]，广泛应用于食品与医药废水处理。鱼苗、虾苗的饲料要求既能提供丰富的营养物质，又能增强苗种的免疫抗病能力，因此，小球藻在水产养殖领域也有很高的应用价值[3]。目前，关于小球藻快速繁殖技术的报道较多[4-10]，一般集中在无机盐培养条件下的快速繁殖技术上，未见在有机质(蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏)培养条件下的快速繁殖技术研究。为此，作者选择3种实验室常用的微生物培养有机质(蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏)，研究其对小球藻生长的影响，以期找到一条短时间内扩繁大量小球藻的途径，为探索小球藻的营养利用方式提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

小球藻(Chlorellazofingensis)，武汉百意欣生物技术有限公司。蛋白胨、酵母提取物，Oxoid；牛肉膏，北京奥博星生物技术有限责任公司。

柠檬酸，EDTA-Na2，柠檬酸铁铵，NaNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCl2，Na2CO3，H3BO3，MnCl2·4H2O，ZnSO4·7H2O，Na2MnO4·2H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O，均为国产分析纯。

SPX-300B-G型光照恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；i3型紫外可见分光光度计，济南海能仪器股份有限公司；AUY120型电子天平，日本SHIMADZU公司。

1.2 培养基的配制

参照文献[11]配制BG-11培养基。

1.3 方法

取400 mL BG-11培养基置于500 mL透明锥形瓶中，分别按质量梯度(0.0 g、1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g)加入121 ℃灭菌15 min的蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏水溶液85 mL。在上述各锥形瓶中，无菌接种15 mL小球藻悬液(A680值为0.10)，用棉塞塞住瓶口，以防污染；置于光照培养箱中，于光照强度为4 500 Lux、温度为25 ℃的条件下培养，每24 h取培养液(取培养液前后将锥形瓶置于25 ℃恒温摇床中150 r·min-1振荡15 min，保证小球藻分散均匀并充分和营养物质接触)，测定其A680值，观察其生长情况。以未接种小球藻悬液的培养液(但含相应浓度的有机质)为空白对照，培养液起始A680值均为0。

2 结果与讨论

2.1 小球藻在以蛋白胨为有机质的培养基中的生长趋势(图1)

从图1可以看出，以蛋白胨为培养基有机质时，随着蛋白胨用量的增加，小球藻的生长速度逐渐加快。当蛋白胨用量为3.0 g时，小球藻在1～8 d的培养时间内，能够保持一定的生长速度，A680值逐渐升高，小球藻生长具有良好的稳定性，有利于小球藻总量的累积；当蛋白胨用量为4.0 g时，培养1～5 d，小球藻生长速度最快，A680值快速升高，但继续延长培养时间，小球藻生长速度减慢，A680值升高不明显，说明过快的增殖代谢，导致一部分小球藻死亡，并不利于小球藻总量的累积；当蛋白胨用量增至5.0 g和6.0 g时，培养6 d后小球藻生长速度有所加快，蛋白胨用量为5.0 g时的累积量最高，且稳步增长。表明，在500 mL培养基中，蛋白胨用量为5.0 g(质量浓度1.00%)时，小球藻的生长情况最好。从节约成本考虑，蛋白胨用量为3.0 g(质量浓度0.60%)是最经济的。

图2为小球藻在以蛋白胨为有机质的培养基中分别培养2 d和8 d时的照片，从培养液颜色深浅来看，其结果与A680值(图1)相符。

图2 小球藻在以蛋白胨为有机质的培养基中分别培养2 d和8 d时的照片Fig.2 Photos of Chlorella zofingensis cultured with peptone as organic matter for 2 d and 8 d

2.2 小球藻在以酵母提取物为有机质的培养基中的生长趋势(图3)

从图3可以看出，以酵母提取物为培养基有机质时，小球藻生长缓慢，且很不稳定；培养5 d的累积量与以蛋白胨为有机质时培养2～3 d的累积量相当；以不同用量的酵母提取物为培养基有机质时均容易导致小球藻死亡，出现生长曲线下滑的情况，这可能与酵母提取物所含的营养元素有关。

图4为小球藻在以酵母提取物为有机质的培养基中分别培养2 d和5 d时的照片，从培养液颜色深浅来看，其结果与A680值(图3)相符。

图3 小球藻在以酵母提取物为有机质的培养基中的生长趋势Fig.3 Growth trend of Chlorella zofingensis cultured with yeast extract as organic matter

图4 小球藻在以酵母提取物为有机质的培养基中分别培养2 d和5 d时的照片Fig.4 Photos of Chlorella zofingensis cultured with yeast extract as organic matter for 2 d and 5 d

2.3 小球藻在以牛肉膏为有机质的培养基中的生长趋势(图5)

图5 小球藻在以牛肉膏为有机质的培养基中的生长趋势Fig.5 Growth trend of Chlorella zofingensis cultured with beef extract as organic matter

从图5可以看出，当牛肉膏用量为1.0～3.0 g时，小球藻经过8 d的培养依然能够保持一定的生长速度，A680值逐渐升高，但小球藻累积量远不如以蛋白胨为有机质时的累积量；当牛肉膏用量为4.0 g时，小球藻在前7 d生长稳定，但第8 d开始出现负增长；当牛肉膏用量增至5.0～6.0 g时，则出现了明显的抑制生长现象。表明，牛肉膏用量越高越不利于小球藻的代谢。

图6为小球藻在以牛肉膏为有机质的培养基中分别培养2 d和8 d时的照片，从培养液颜色深浅来看，其结果与A680值(图5)相符。

图6 小球藻在以牛肉膏为有机质的培养基中分别培养2 d和8 d时的照片Fig.6 Photos of Chlorella zofingensis cultured with beef extract as organic matter for 2 d and 8 d

2.4 讨论

3种常用微生物培养有机质对小球藻生长的影响均与有机质的化学组成相关。蛋白胨的分子量在2 000左右，介于和肽之间，是一个复杂的多肽混合物，是动物性、植物性、微生物性的蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后形成的，富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类，能为小球藻提供碳源、氮源、生长因子等营养物质。酵母提取物是酵母菌破壁后经抽提得到的蛋白质、核酸、维生素等经生物酶解得到的富含氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的物质，其中总蛋白50%以上，氨基酸30%以上，核苷酸10%以上。牛肉膏是新鲜牛肉剔除脂肪后经消化、过滤、浓缩而得到的膏状物，是含肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。

在微生物培养中，蛋白胨主要提供氮源和维生素，相比牛肉膏，蛋白胨的来源广泛，可以为小球藻提供更多种类和数量的有机氮源(氨基酸和肽类)，完全可以满足小球藻快速生长的需要。牛肉膏提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，其主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的不足，用量一般为0.3%～0.5%；牛肉膏成分复杂，氮源是比较单一的动物源性的，其它营养成分虽然能促进大部分微生物生长，但并不适合小球藻的生长，甚至和小球藻代谢物发生作用，从而起到抑制作用。与蛋白胨和牛肉膏相比，酵母提取物的氮源(可能主要是氨基酸)就更单一了，虽然其氨基酸和总蛋白含量很高，但是并不能满足小球藻生长的需要，可能与氨基酸的种类和含量有关。

3 结论

小球藻的快速生长需要多种氮源，在额外提供无机离子的情况下，蛋白胨对小球藻生长的促进作用最大，其次是牛肉膏，酵母提取物几乎不能促进小球藻生长。在蛋白胨质量浓度为1.00%时，小球藻的生物累积量达到最高；考虑到经济成本，蛋白胨的质量浓度以0.60%为宜。