超声作用下乳蛋白-磷脂复合体系对人乳脂类似物乳液形成与稳定的影响

覃小丽，杨溶，钟金锋，刘雄

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

当纯母乳喂养因生理和文化等原因不能进行时，婴儿配方奶粉作为营养产品是理想选择。在婴儿配方奶粉生产的均质步骤中，人乳脂类似物乳液的形成通常通过蛋白质(如乳清蛋白、酪蛋白)和非蛋白乳化剂(如磷脂、甘油一酯)实现[1]。所得的人乳脂类似物乳液通过喷雾干燥转化为奶粉或通过一定灭菌方式获得液态形式的婴儿配方奶产品。人乳脂类似物乳液的形成和稳定性被认为是影响婴儿配方奶粉质量的因素之一。近年来，大多数研究主要集中在乳化剂的类型和组成[2-5]、非乳化剂成分(如乳糖)[6]、环境因素[7]和抗氧化剂[8-9]对人乳脂类似物乳液的形成和稳定性的影响。高压均质方法是生产人乳脂类似物乳液的传统均质方法。高压均质法通常在两步高压均质条件(>10 MPa)下依赖强烈的剪切、撞击和空穴作用得到分散体。许多研究表明，超声均质法可以用于制备稳定的纳米乳液[10-15]。YAO等[16]报道高压均质使蛋白质吸附到牛乳脂肪球的油水界面形成了一层较厚的新脂肪球膜，导致其天然膜结构和组分含量发生了显著变化。此类结构的变化进而影响乳脂在体外模拟婴儿胃肠消化环境中的消化特性(脂肪、蛋白质水解)[17]。然而，其他类型均质方法应用于人乳脂类似物乳液制备的相关研究较少[18]，超声均质法对人乳脂类似物乳液的形成和稳定的影响机理尚待解决。

因此，以乳蛋白-磷脂复合体系为研究对象，研究超声时间(0～35 min)和超声功率(0～600 W)对乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质的影响；此外，初步探索不同超声处理条件下乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质变化与人乳脂类似物乳液形成和稳定的关系，为生产物理稳定良好的人乳脂类似物乳液提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白(纯度为80%)、酪蛋白和大豆磷脂，合肥博美生物科技有限责任公司；超纯水，YSL-RO-T10L/H超纯水系统(Ashland公司)制备；大豆油，重庆红蜻蜓油脂有限责任公司；油茶籽油，江西春源绿色食品有限公司；椰子油，上海冉浩实业有限公司；考马斯亮蓝G-250、8-苯胺-1-萘磺酸等试剂，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

Zetasizer Nano ZS90激光粒径仪，英国Malvern公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均质机，德国IKA公司；JY98-IIIDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；PB-10标准型pH计，德国赛多利斯公司；UV-2450型紫外分光光度计，日本岛津公司；F-2500型荧光分光光度计，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳蛋白-磷脂复合体系的超声处理

分别称取一定质量的酪蛋白、乳清蛋白和磷脂于同一个烧杯中，加入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)使其质量分数分别为0.70%、1.05%和0.5%，于30 ℃下磁力搅拌2 h，置于4 ℃静置12 h保证蛋白质充分溶胀，得到乳蛋白-磷脂复合体系；此外，称取相同质量的乳蛋白(酪蛋白、乳清蛋白)于烧杯中，加入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，按照乳蛋白-磷脂复合体系的溶解条件进行，得到乳蛋白溶液(质量分数之和为1.75%)，此溶液作为对照组。将超声波细胞粉碎机的钛探头插入样液液面下2 cm处，在20 kHz下对2种样液进行超声处理(作用时间5 s，间隔时间3 s)，用冰水浴使样液温度不超过35 ℃。超声时间和功率的范围按照QIN等[12]的研究确定，具体条件如表1所示。

1.3.2 乳蛋白-磷脂复合体系的性质表征

1.3.2.1 溶解度

参照孙燕婷等[19]和SN/T3926—2014的方法测定样液中可溶性蛋白质的浓度。对超声处理前后的样液进行离心(10 000 r/min，10 min)，取上清液0.1 mL于10 mL具塞试管中加入5 mL考马斯亮蓝G-250染色液，使用紫外分光光度计在595 nm处测定样液的吸光值。以牛血清白蛋白为标准物绘制标准曲线，样液的溶解度表示为上清液可溶性蛋白质量相对于总蛋白质量含量的百分比。

表1 不同超声处理参数Table 1 Different ultrasonic treatments

注：U-0、U-1、U-15和U-35为在不同超声时间处理所得的样品；U-0、U-60、U-15和U-600为在不同超声功率处理所得的样品

1.3.2.2 表面疏水性

乳蛋白的表面疏水性参照KATO等[20]的方法并稍作调整。将超声处理前后的样液于7 000 r/min离心20 min，取上清液，用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH=7.0)将上清液稀释成不同的浓度梯度(0.005～0.04 mg/mL)。取4 mL各浓度的溶液，与40 μL的8-苯胺-1-萘磺酸溶液(8 mmol/L)振荡均匀，避光静置10 min保证充分反应，用荧光分光光度计测其荧光强度，具体参数设置激发波长365 nm，发射波长468 nm，夹缝为5 mm，扫描速度10 nm/s。以荧光强度对蛋白质浓度作图，其初始段斜率(通过线性回归分析计算)即为表面疏水性值。

1.3.2.3 浊度

采用可见紫外分光光度计测定不同超声处理的乳蛋白-磷脂复合体系的浊度。样液用超纯水稀释100倍，于600 nm处测量稀释样品的吸光度。以超纯水作为空白对照。根据公式(1)计算各样液的浊度：

(1)

式中：A，样品稀释后测定的吸光度；V，稀释倍数；L，比色皿的宽度，1 cm。

1.3.2.4 粒径和ζ-电位

采用Zetasizer Nano ZS 90测定样液的粒径和ζ-电位。为了尽量降低多重光散射效应，将样液用超纯水稀释1 000倍。水相溶液的折射率设置为1.33，测试温度为25 ℃，平衡时间为2 min。每个样品平行测定3组，每组测定3次，每次测量值为13个子测试运行结果的平均值。

1.3.3 人乳脂类似物乳液的制备

以乳蛋白和磷脂为乳化剂，人乳脂类似物为油相，采用超声均质法制备人乳脂类似物乳液。首先，分别称取乳清蛋白、酪蛋白和磷脂于烧杯中，加入适量水于30 ℃下磁力搅拌2 h，调节水相pH值为6.8，使乳清蛋白、酪蛋白和磷脂的质量分数分别为1.05%、0.70%和0.5%，添加叠氮化钠溶液(最终浓度为0.02%)抑菌，置于4 ℃静置12 h使其中的乳蛋白充分溶胀，获得水相。然后，按照QIN等[12]研究方法，将4种油[m(33L-分提猪油)∶m(油茶籽油)∶m(大豆油)∶m(椰子油)=54.80∶19.78∶15.14∶10.28)]物理混合制备成人乳脂类似物。将1.75 g人乳脂类似物添加于水相，搅拌(500 r/min，5 min)后高速均质(20 000 r/min，2 min)后，获得粗乳液。最后，采用超声处理粗乳液(工作时间为5 s，间歇时间为3 s)，用冰水浴使乳液温度不超过35 ℃，得到人乳脂类似物乳液。以粒径为评价指标，研究超声条件对乳液形成与稳定的影响，具体超声条件同表1。乳液的平均粒径测定按照1.3.2.4进行。

1.4 数据处理

每组试验至少重复2次，每个样品的各指标至少平行测定3次，结果以平均值±标准偏差表示。使用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析(P<0.05时判断组间存在显著差异)，并采用Spearman相关系数分析乳液的平均粒径与乳蛋白-磷脂复合体系的物理性质之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质的影响

2.1.1 粒径和浊度

超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系的粒径和浊度的影响如图1所示。超声处理后，乳蛋白-磷脂复合体系及对照组(乳蛋白溶液)的平均粒径均显著降低。粒径尺寸的减少可能归因于超声空化现象，其可导致湍流和高剪切力[17]。这种湍流和高剪切力使乳蛋白和磷脂聚集体破碎成较小的聚集体。在超声前，乳蛋白-磷脂复合体系的平均粒径(317.97 nm)大于乳蛋白溶液的平均粒径(248.03 nm)，但超声处理后乳蛋白-磷脂复合体系的平均粒径却较小(图1-A、图1-B)。这可能因为磷脂是一种小分子乳化剂且具有一定黏稠性，因此在超声处理前其在水中以大的聚集体形式存在，经过超声空化作用后则被剧烈搅动破碎成更小的聚集体。因此，与乳蛋白溶液相比，乳蛋白-磷脂复合体系经超声后其平均粒径有更大程度地减小。

浊度作为一个支持性参数用于评估分散体中的粒径变化[21]。如图1-C、图1-D所示，当超声时间较短(1 min，样品U-1)或功率较低(60 W，样品U-60)时，浊度已有显著降低。这是因为在超声空化和机械搅拌下，大的磷脂聚集体迅速地破碎成小颗粒，小颗粒具有较大表面积因而增加了光的散射，从而降低了浊度。随着超声时间的延长或功率的增大，样品浊度显著降低。可见，超声处理能有效降低乳蛋白-磷脂复合体系及对照组的浊度；且浊度与粒径变化呈正比(R2>0.98)。

2.1.2 表面疏水性

表面疏水性可衡量蛋白质分子表面上与极性水环境接触的疏水基团数量，并且与其功能特性密切相关[22]。图2显示了超声对乳蛋白-磷脂复合体系中蛋白表面疏水性的影响。在相同的超声处理条件下，乳蛋白-磷脂复合体系的表面疏水性是对照组(乳蛋白质溶液)的1.6～2倍。乳蛋白溶液和乳蛋白-磷脂复合体系中乳蛋白的质量分数虽然相同，但是乳蛋白-磷脂复合体系中蛋白的表面疏水性明显大乳蛋白溶液。这可能主要有2个原因。其一，当超声时间延长至35 min或超声功率增大至600 W，对照组(乳蛋白溶液)的表面疏水性显著增加(图2)，这表明超声处理引起蛋白质结构发生一定程度的展开，使埋藏在蛋白质内部的疏水基团暴露，因而乳蛋白的表面疏水性增加[23]。有研究指出不同来源的蛋白质(如乳清浓缩蛋白[24]、豌豆分离蛋白[25]、扇贝蛋白[26])经超声处理后其表面疏水性增加。其二，与对照组(乳蛋白溶液)相比，乳蛋白-磷脂复合体系具有较高的表面疏水性。这表明乳蛋白和磷脂之间存在相互作用(主要为疏水相互作用[27])，该相互作用使蛋白质结构发生进一步改变，蛋白质分子表面上暴露出更多疏水基团，因而使乳蛋白-磷脂复合体系中的乳蛋白的表面疏水性增加。

A-不同超声时间对平均粒径的影响；B-不同超声功率对平均粒径的影响；C-不同超声时间对浊度的影响；D-不同超声功率对浊度的影响图1 超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系的平均粒径和浊度的影响Fig.1 Effect of ultrasonic treatment on the z-average diameter and turbidity of milk protein-lecithin solution注：不同颜色不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)

A-不同超声时间；B-不同超声功率图2 超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系的表面疏水性的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on the surface hydrophobicity of milk protein-lecithin solution

2.1.3 溶解度

蛋白质溶解度是反映蛋白质变性和聚集情况的最实用方法，可作为蛋白质功能评价的关键指标。图3显示了超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系的溶解度的影响。当超声时间延长至35 min或超声功率增大至600 W时，乳蛋白-磷脂复合体系中蛋白溶解度分别提高了1.52%和1.75%。这些结果表明，通过延长超声时间和增大超声功率可以改善乳蛋白-磷脂复合体系中蛋白的溶解度。其他课题组也报道了类似的结果[23, 28-30]，这些研究显示超声处理可以提高分离(或浓缩)蛋白的溶解度。超声处理后乳蛋白溶解度的提高可归因于其表面疏水性的增加(图2)和蛋白质粒径的减小(图1)，在一定程度上增加了乳蛋白与水的相互作用。然而，乳蛋白-磷脂复合体系中蛋白溶解度提高程度低于乳蛋白溶液(超声时间为35 min和600 W时分别提高了3.24%和3.21%)。这可能是因为乳蛋白-磷脂复合体系中磷脂与乳蛋白之间存在相互作用(从图2中乳蛋白-磷脂复合体系的表面疏水性明显增加可推测)，减少了乳蛋白与水的相互作用的程度，因此其溶解度提高程度低于乳蛋白溶液的溶解度。

一些研究发现，蛋白质表面疏水性越大，蛋白质溶解度越大[23, 31]。然而，在本研究中，与具有较低表面疏水性的乳蛋白溶液相比，具有较高表面疏水性的乳蛋白-磷脂复合体系的蛋白质溶解度并未增大(图2 和3)。这些不同的研究结果可能归因于分子间相互作用程度的差异。在溶液中没有其他类型化合物存在的情况下，暴露在蛋白质表面的疏水基团可以与该溶液中的水相互作用；而在本研究乳蛋白-磷脂复合体系中，暴露在蛋白质表面的疏水基团不仅可以与体系中的水分子相互作用，而且与磷脂发生相互作用。相比于乳蛋白溶液，乳蛋白-磷脂复合体系的蛋白表面疏水性虽然较大(图2)，但其蛋白溶解度略有降低(图3)。

A-不同超声时间；B-不同超声功率图3 超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系的溶解度的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment on the solubility of protein-lecithin solution

2.1.4 ζ-电位

ζ-电位是溶液中颗粒表面电荷密度的量度，是评价胶体分散的潜在稳定性的关键指标。对于静电稳定的分散体，ζ-电位的绝对值通常需要大于30 mV以防止分散体中颗粒聚集[32]。如图4所示，在超声处理前，乳蛋白-磷脂复合体系的ζ-电位绝对值为28.85 mV；当在超声时间为1 min或超声功率为60 W时，乳蛋白-磷脂复合体系的ζ-电位绝对值分别达到最大值(30.90 mV、31.25 mV)。ζ-电位绝对值的增加可归因于超声处理过程中磷脂聚集体的破碎，从而使磷脂的阴离子基团暴露在其分子表面。然而，当超声时间延长至35 min或功率增大至600 W时，ζ-电位绝对值呈降低趋势。这可能归因于通过超声处理使蛋白质分子的表面结构发生变化(图2)，从而减少了蛋白质分子上的表面负电荷(图4)。ζ-电位绝对值的降低会削弱颗粒之间的静电排斥力，进而可能影响分散体的稳定性。

A-不同超声时间；B-不同超声功率图4 超声处理对乳蛋白-磷脂复合体系中ζ-电位的影响Fig.4 Effect of ultrasonic treatment on the ζ-potential of milk protein-lecithin solution

2.2 超声处理对乳液形成与稳定的影响

以乳蛋白和磷脂为乳化剂，研究超声时间与功率对人乳脂类似物乳液的形成与稳定的影响，结果如图5所示。经过高速搅拌获得的粗乳液在超声处理前的粒径最大(257.13 nm)，放置144 h后出现分层现象。随着超声时间或功率的增加，乳液的粒径逐渐减小(图5)。通常，乳液的粒径稳定性取决于初始粒径，并且具有较小初始粒径的乳液可在更长的时间内保持稳定[33]。如图5所示，当超声时间分别为1、15和35 min时，乳液粒径在144 h后分别增大了4.21、7.78和17.42 nm；当超声功率分别为60、300和600 W时，乳液粒径在144 h后分别增大了4.91、7.78和10.76 nm。虽然超声时间最长的乳液(U-35)和超声功率最大的乳液(U-600)具有较小的初始粒径，但放置144 h后乳液粒径的增大程度最大。这可能与乳化剂(乳蛋白和磷脂)在超声过程中表面电荷发生改变有关(图4)，其ζ-电位绝对值的降低减弱了颗粒之间的静电排斥力，因而使乳液液滴易聚集、粒径变大程度大。

A-不同超声时间；B-不同超声功率图5 不同超声条件下制备的乳液平均粒径Fig.5 The z-average diameter of emulsions prepared under different ultrasonic conditions

2.3 不同超声条件下乳液的粒径变化与乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质的关系

表2总结了人乳脂肪类似物乳液中粒径变化与乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质之间的相关性。乳液的粒径与乳蛋白-磷脂复合体系的表面疏水性、溶解度的相关系数为r=-1.000(P<0.01，n=4)，表明乳液的粒径变化分别与乳蛋白-磷脂复合体系的表面疏水性和溶解度的变化呈负相关性，即随着超声时间的延长或功率的增大，乳蛋白-磷脂复合体系的表面疏水性和溶解度越大，越有利于形成更小粒径的乳液。乳液的粒径分别与乳蛋白-磷脂复合体系的浊度呈正相关(r=-1.000，P<0.01，n=4)。随着超声时间的延长或超声功率的增加形成更小粒径的人乳脂肪类似物乳液，可从如下2个方面考虑：(1)当超声时间或超声功率增加时，乳蛋白和磷脂的大聚集物在超声空化和剪切力作用下而形成更小的聚集体，从而减小了颗粒粒径(图1-A、图1-B)。乳蛋白和磷脂颗粒的粒径降低以及蛋白质结构的展开(表现在表面疏水性的增加，图2)使乳蛋白与水之间的疏水相互作用增强。因此，增加了乳蛋白的溶解度(图3)，这有利于增加其乳化活性[34]并形成具有小粒径的乳液。(2)两种乳化剂(乳蛋白质和磷脂)之间存在疏水相互作用，磷脂的存在明显提高了乳蛋白的表面疏水性(图2)，从而利于乳蛋白和磷脂的疏水基团吸附在小油滴表面上，因此防止可或减缓油滴在乳液形成过程中聚集。

乳液的粒径与乳蛋白-磷脂复合体系的ζ-电位之间虽然没有显著相关性(表2)，但是乳液在储藏过程中粒径增长程度(图5)与乳蛋白-磷脂复合体系的ζ-电位绝对值成反比。在长时间超声或高功率下获得的乳液粒径增大程度可能是由于乳蛋白-磷脂复合体系的ζ-电位绝对值较低造成(图4)，进而可能影响乳液的长期稳定性。

表2 乳液粒径与乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质 的关系Table 2 The correlation of z-average diameter in emulsions and physiochemical property of protein-lecithin solution

注：**相关性在0.01水平(双侧)显著

3 结论

探究了不同超声时间和功率下的乳蛋白-磷脂复合体系的理化性质及其对人乳脂类似物乳液形成与稳定的影响。结果表明，该复合体系中乳蛋白和磷脂之间存在的相互作用使乳蛋白的表面疏水性明显提高，超声处理也提高了乳蛋白的表面疏水性和溶解度以及降低乳蛋白-磷脂复合体系的粒径，这些变化均有利于乳蛋白和磷脂的疏水基团吸附在超声均质过程中形成的小油滴表面上，形成粒径较小的乳液。此外，超声时间的延长或超声功率的增大使乳蛋白-磷脂复合体系的ζ-电位绝对值降低，这是导致具有较小粒径的人乳脂类似物乳液在短期内粒径增大程度快的原因，可能影响乳液的长期物理稳定性。研究结果为超声均质法应用于生产婴儿配方奶粉的品质调控提供了依据。