高效液相色谱法测定蓝莓酒中六种花青素含量

王欢，谯顺彬，田辉，石瑞丽，彭小东

1(贵州工业职业技术学院，贵州 贵阳，550008)2(贵州省产品质量检验检测院，贵州 贵阳，550016)

花青素是一种水溶性色素，属黄酮类化合物，其基本结构母核是2-苯基苯并吡喃，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。有实验证明，花青素是目前清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂，是VC的20倍，VE的50倍，能防治多种疾病，改善人体微循环[1]。蓝莓(Vaccinium spp.)，别名越橘、蓝浆果，为杜鹃花科越橘属多年生落叶或是常绿灌木。蓝莓果实柔软多汁，营养丰富，富含花青素、槲皮素等多种黄酮类化合物及其他类生理活性成分。研究表明，蓝莓果实有很强的抗氧化活性，具有提高人体免疫力、防止脑神经老化、改善视力、降低血糖血脂、预防癌症等多种生理功能[2-3]。

蓝莓酒是以蓝莓果实为主要原料，经过加工酿制以后得到的果酒，因其独特的口感和丰富的营养而受到消费者的欢迎。但是目前针对蓝莓酒中花青素的检测报道较少，而且考察的花青素种类也不全[4]，因此建立一种快速、有效的蓝莓酒中多种花青素的检测方法具有重要的意义。目前，常用的花青素检测方法有可见光分光光度法[5-7]、高效液相色谱法[8-10]及高效液相色谱-质谱联用法[11-12]等。其中，可见光分光光度法一般测定的是样品中花青素总的含量，不能确定单一组分含量，且易受干扰，结果准确度较低；高效液相色谱-串联质谱法检测灵敏度高，但设备昂贵，且由于花青素在低pH值下稳定，而低pH值对电喷雾质谱的离子化会有一定的抑制作用，影响质谱分析[13]。综上，本文采用高效液相色谱法来建立同时测定蓝莓酒中6种花青素的检测方法，并对前处理步骤和检测条件进行优化，为开展蓝莓酒的功能性研究提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试样，自制蓝莓酒。

花青素标准品(飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素、锦葵色素)，ChromaDex公司；乙腈(色谱纯)，德国默克公司；H3PO4、HCl、无水乙醇(均为分析纯)，国药集团公司；实验用水为经超纯水仪处理的一级水。

Aglient 1260 Ⅱ高效液相色谱仪(配DAD检测器)，美国安捷伦公司；混匀振荡器，Heidolph公司；SB25-12DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；干燥箱，德国BINDER；电子天平(精度0.000 1 g)，瑞士Mettler Toledo公司；移液器，德国普兰德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色谱条件

Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)，美国安捷伦公司；流动相A，0.1%的H3PO4溶液；流动相B，乙腈；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温40 ℃；紫外检测器检测波长525 nm；梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.2.2 标准曲线的配制

标准储备液：分别准确称取6种花青素标准物质5.0 mg(精确至0.1 mg)于50 mL容量瓶中，10%的盐酸甲醇溶液溶解并定容，得100 mg/L的标准储备液，-20℃下避光保存。

标准混合中间液：准确吸取1 mL各标准储备液至10 mL的容量瓶中，10%HCl定容至刻度，制得10.0 mg/L标准工作液。

1.2.3 样品前处理

提取：准确称取1.00～5.00 g的蓝莓酒样品于25 mL的容量瓶中，用提取试剂V(乙醇)∶V(H2O)∶V(HCl)=2∶1∶1定容至刻度，超声振荡提取30 min。

水解：超声提取后，密封好瓶塞，于120 ℃下水解1 h，取出冷却至室温，提取液再次定容，过0.45 μm的水系膜，待上机。

1.2.4 计算公式

花青素含量的计算，如公式(1)所示：

(1)

式中：Xi为样品中各花青素的质量分数，mg/kg；Ci为标准曲线定量的样品各花青素的质量浓度，mg/L；C0为空白的花青素的浓度，mg/L；V为定容体积，mL；m为取样质量，g；d为稀释倍数。花青素总量为各个花青素测定值之和。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

参考文献[13]，花青素需在较低pH下进行分离测定，且6种花青素的结构相近，一般短的C18柱达不到分离效果，而长柱虽能达到分离效果但会占用较长的分析时间，因此选择能够耐低pH且分离度较高的Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，结合花青素各组分的分离度及样品分析时间考虑，经过反复调节流动相比例及梯度，最后得到最优的梯度洗脱程序如表1所示。

由图1和图2可知，6种花青素的出峰时间在10 min以内，分析时间短，且样品跟标液均能达到很好的分离度。由图2可知，蓝莓酒中检出了5种花青素，其中天竺葵色素未检出，这与胡莉等研究的蓝莓中未检出天竺葵色素的情况相符[13]。

2.2 检测波长的选择

在确定最佳色谱条件后，本试验采用DAD检测器对6种花青素进行全波长扫描(190～600 nm)。由图3可知，除天竺葵色素的最大吸收波长为512 nm，其余5种花青素的最大吸收波长在525 nm左右，因此综合考虑检测灵敏度及效率值(无需切换波长)，统一检测波长为525 nm。

1-飞燕草色素;2-矢车菊色素;3-矮牵牛色素;4-天竺葵色素;5-芍药素;6-锦葵色素图1 六种花青素标准物质色谱图Fig.1 The chromatogram of anthocyanins

a-飞燕单色素；b-矢车菊色素；c-矮牵牛色素；d-天竺葵色素；e-芍药素；f-锦葵色素图3 六种花青素的全波长扫描图Fig.3 Full-wavelength scanning of 6 kind of anthocyanins

2.3 方法的线性及检出限

将1.2.2的标准混合中间液进行梯度稀释，配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列标准工作液。结果表明，6种花青素在质量浓度为0.5～10 mg/L线性良好(r>0.999 9)。采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的信噪比(S/N)的3倍确定检出限，得到6种花青素的检出限结果如表2所示。

2.4 蓝莓酒样品中花青素的测定及方法的回收率、精密度、稳定性

蓝莓酒样品中花青素的测定方法为准确称取1.00 g 蓝莓酒样品，3个平行，按照1.2.3的方法进行前处理，上机分析，结果如表3所示。

表2 花青素的线性方程及检出限Table 2 Linear equations and LOD of anthocyanins

表3 蓝莓酒中花青素的质量浓度Table 3 The quality concentration of anthocyanins in blueberry wine

注：-代表未检出

结果表明，蓝莓酒中检出5种花青素，未检出天竺葵色素。5种花青素的含量从高到低分别为锦葵色素 29.49 mg/kg；矢车菊色素 17.02 mg/kg；飞燕草色素 11.32 mg/kg；矮牵牛色素 6.71 mg/kg；芍药素 4.17 mg/kg，RSD在0.65%～5.89%(表3)。

对蓝莓酒中花青素进行测定后，准确称取1.00g蓝莓酒样品，分别加入5、10和20 mg/kg花青素混合标液，每个浓度3个平行，按照1.2.3的方法进行前处理，上机分析，结果如表4所示，6种花青素的回收率为80.50%～108.80%，RSD在0.54%～5.63%。

表4 蓝莓酒中6种花青素的回收率Table 4 Recovery of anthocyanins in blueberry wine

精密度和稳定性测定方法为：将6种花青素的混合标准品溶液(1 mg/L)，分别于0、2、4、8、12、24 h 各进样 1 次，记录其峰面积和保留时间，计算 RSD、叠加色谱信号，结果如表5和图4所示。

表5 六种花青素的精密度和稳定性Table 5 The precision and stability of anthocyanins

图4 花青素混合标准溶液叠加色谱图Fig.4 The overlapped chromatograms of anthocyanins mixed standard solution

由表5和图4可知各组分的峰面积在24 h内无明显变化，RSD<3.00%；保留时间稳定，结果表明方法的精密度和稳定性良好。

2.5 水解温度选择

花青素主要以花色苷的形式存在，试样通过水解后生成花青素，因此水解温度直接影响花青素的形成。为有更多的温度选择，得到更好的水解效果，本试验选择在烘箱中进行加热水解反应，温度在70、80、90、100、110、120、130 ℃，水解1 h，考察温度对各花青素质量分数的影响。

如图5所示,当温度在120 ℃时，各花青素质量分数最高，120 ℃以上时略有下降，且温度越高，花青素降解的速度越快，前处理对密封的要求也越高，且易发生喷溅，综合考虑，选择120 ℃作为最佳水解温度。

图5 水解温度的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature

2.6 水解时间选择

水解时间的长短也直接影响花青素质量浓度的高低。实验选择在120 ℃水解20、30、45、60、90、120 min，考察水解时间对花青素质量浓度的影响。如图6所示,60～90 min，各花青素质量浓度达到最高，90 min后开始下降，结合时效考虑，选择60 min的水解时长为最佳。

图6 水解时间的影响Fig.6 Effect of hydrolysis time

3 结论

本文研究建立了蓝莓酒中的6种花青素的高效液相色谱检测方法，检出蓝莓酒中含有飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、锦葵色素5种花青素，其中锦葵色素含量最高(29.49 mg/kg)，矢车菊色素(17.02 mg/kg)、飞燕草色素(11.32 mg/kg)次之。实验采用烘箱加热水解的方式，在温度为120 ℃，水解时间为60 min时，花青素的提取效果最佳，优化了提取和色谱条件，方法的线性良好，检出限较低，精密度和稳定性良好，回收率在80.50%～108.80%，可作为蓝莓酒中花青素快速检测的参考方法。