人发角蛋白生物材料的医学应用

胡伟 唐红枫

摘 要 近几十年来，天然衍生生物材料以其良好的生物功能、结构支撑、良好的生物相容性和良好的生物降解性，在组织工程和再生医学中得到了广泛的应用。传统上，角蛋白是从羊毛、羽毛、角和其他动物源中提取的用于工业用途的，它也被用作生物材料来开发用于生物医学应用的支架、水凝胶和其他形式。近年来，从人发中提取的角蛋白作为一种来源于人体的蛋白质，具有良好的生物相容性、移植后无免疫反应、良好的细胞相互作用活性和生物降解性。近年来，人类毛发角蛋白提取技术的发展导致了各种类型的角蛋白生物材料的制备，这些材料已成功的用于组织再生医用材料的制备。利用人发角蛋白为基础的生物材料来进行转化生物医学应用，需要更好地了解角蛋白的分子特性和生物学功能。本文就人发角蛋白的分子特性、细胞间的相互作用、各种提取方法以及近年来在生物医学上的应用进展作一综述。

关键词 人发角蛋白 生物材料 组织工程

1概述

近十年来，各种生物材料，包括合成聚合物、金属、生物陶瓷和天然衍生生物材料，在组织工程和再生医学领域得到了广泛的应用。胶原等天然生物材料因其良好的生物相容性、生物功能性和生物降解性，在临床应用中受到广泛关注。例如，胶原蛋白在临床上被广泛用作真皮填充物、牙屏障膜、敷料膜、神经导管等，尽管它们与宿主细胞外基质相似，但在还存在很多问题值得研究，天然生物材料在临床应用上的一个重要问题是体内植入后产生的免疫反应，包括由于其提取源而引起的过敏反应。因此，通过化学改性来改善生物相容性是当前的研究热点。由于人发角蛋白是人源性的，具有优异的生物相容性，具有细胞相互作用的位点，并且表现出良好的生物相容性，被认为是一种有效的天然来源的降解性生物材料。此外，据报道，全球每年约有300000吨毛发被丢弃，从理发店、医院等废弃物中提供富含角蛋白的资源。传统上从动物硬组织如羊毛、羽毛和角中提取的9种角蛋白已广泛应用于化妆品行业。但从这些动物源中提取角蛋白的强酸强碱等剧烈条件会在一定程度上破坏角蛋白的三维结构，而在相对温和的条件下从人发中提取角蛋白的最新进展，已导致大量角蛋白生物材料的成功应用。本报告综述了人发角蛋白的分子特性、各种提取方法以及近年来在生物医学领域的应用。

2角蛋白的分子特性

角蛋白是一种天然蛋白质，属于中空纤维，是桥粒细胞连接的细胞骨架成分。角蛋白分为两类，即Ⅰ型（酸性）角蛋白和Ⅱ型（碱性）角蛋白。在头发、角、羽毛和指甲中发现的硬角蛋白（5%硫）被分为Ia型（酸性硬蛋白）和IIa型（碱性硬蛋白），而表皮角蛋白如皮肤角质层（1%硫）被分为Ib型（酸性软蛋白）和IIb型（碱性软蛋白）;分类取决于氨基酸的组成、分布和功能。硬角蛋白和軟角蛋白在螺旋构象中具有相似的肽结构，但它们的氨基酸组成不同，一般来说，硬角蛋白以其高半胱氨酸含量、低甘氨酸含量和具有结构耐久性和强度而区别，而软角蛋白则相反。关于二级结构，角蛋白可进一步分为两类：具有 螺旋结构的 角蛋白和具有 折叠片层结构的 角蛋白。人发角蛋白分为硬角蛋白，由65-96%的蛋白质、1-9%的脂质、3%的黑色素和少量化合物组成，主要取决于水分含量。人的头发纤维包含三个不同的部分：角质层、皮层和髓质。角质层是头发纤维的外层，主要由5-12层 角蛋白组成，起保护内层和保持水分的作用;皮层是一束蛋白质链，主要由 角蛋白（50-60%）、 角蛋白（20-30%）和黑色素颗粒组成，人发角蛋白存在于皮质内，占整个头发总质量的70-95%;髓质是位于毛发纤维中心的柔软疏松的轴向细胞。存在于皮质层的 角蛋白，由于其独特的结构和生物学功能，在生物医学工程中得到了广泛的应用。在人发中， 角蛋白的两个亚型，Ⅰ型（酸性）角蛋白和Ⅱ型（碱性）角蛋白相互作用，形成左手异二聚体螺旋。然后两个二聚体反平行结合形成右手四聚体，这个过程持续进行，直到随后聚合成10纳米长的螺旋状中间丝。在卷绕线圈中间长丝形成过程中，在形成二聚体、四聚体、八聚体等的各个阶段都会改变螺旋方向。最后， 角蛋白的超薄结构纤维的形成由数千束微纤维完成（图1）。 角蛋白单体的分子量为40-50 kDa（I型）和50-60 kDa（II型）。在头发中发现的 角蛋白，也称为基质蛋白或角蛋白相关蛋白（KAPs），是一种分子量为10-25kda的高硫 角蛋白，作为粘合材料将细丝结合在一起并维持头发纤维的结构。

3角蛋白的生物学特性

毛发角蛋白是在毛发发育周期中形成于上皮卵泡细胞的细胞内细胞骨架蛋白，包括生长期（生长期）、增殖期（生长期）和休止期（休止期）。表皮生长因子、细胞因子和其他信号分子等化学信号参与了各个阶段的调节。生长是毛囊周期的第一阶段，BMP信号已经被证明是在此阶段参与毛囊分化。毛囊细胞在生长期角质化，角质单体聚合成中间丝，完全角化的细胞最终通过凋亡而死亡，包括中间丝在内的内部细胞器被排出体外。由内根鞘（IRS）和外根鞘（ORS）覆盖的发干（HS）变得密集地充满角蛋白丝。发干中的角蛋白从头皮中出来并暴露于空气中，导致角蛋白的氧化，最终形成细长的纤维结构。生长期过后，来到了动态过渡期，在此期间，头发生长结束，毛囊进入休息期，导致脱发，然后开始一个新的周期。角蛋白的主要功能之一是保护上皮细胞免受物理损伤和非物理应激，但最近有报道称，角蛋白也具有其他细胞蛋白功能的调节，包括参与细胞信号传导，以及应激相关机制。头发中的角蛋白形成了细胞内的细胞骨架中间丝，对于细胞起到支撑作用，然而人发中角蛋白的除结构支撑以外其他的生物学功能尚未得到很好的阐明。最近报道，角蛋白分子由约400～600个氨基酸组成，含有多种细胞结合位点，如LDV（LU-ASP-VALL）和RGD（ARG-GLY ASP）。例如，毛发角蛋白被用作细胞培养的涂层材料时，支持细胞粘附和提高细胞增殖。据报道， 4 1整合素家族在细胞中识别出含有类似细胞粘附基序的角蛋白基质，在人发角蛋白膜上培养的细胞中观察到发育良好的 1整合素表达（图2）。角蛋白作为一种细胞外基质，具有支持细胞间相互作用和细胞间基质相互作用的生物学功能，已成为许多生物医学应用的潜在生物材料。然而，细胞与角蛋白基生物材料相互作用的机理仍需进一步研究。

4人发角蛋白提取方法

传统方法是从动物源（如羊毛、角和头发）中提取角蛋白，对传统方法进行稍加改进的方法可以用来从人类头发中提取角蛋白。头发中的硬角蛋白由于其角蛋白分子和疏水氨基酸中胱氨酸残基中的二硫键含量高而高度不溶，因此头发中硬角蛋白的提取需要苛刻的条件和进一步的修饰以稳定角蛋白分子，其中首要问题就是能够在不破坏肽键的情况下使二硫键断裂，从而从头发中提取角蛋白。如图3所示，头发角蛋白的提取过程包括四个步骤，包括去甲酰化、增溶、透析和冷冻干燥。在提取过程中， 角蛋白主要从皮质层中提取，并通过离心去除嵌入表皮层中的不溶性 角蛋白。为了有效地从人发中提取角蛋白，许多研究人员开发了多种技术，使用各种试剂的混合物以及热、机械力和水解缓冲液的组合。这些过程是基于氧化还原化学反应来打破硬角蛋白中的二硫键和增加角蛋白溶解度的试剂。对于这些提取条件的总结（见表1）。在基于还原法的角蛋白提取中，角蛋白分子中的二硫桥很容易被打破，并通过碱性水解还原为巯基，生成角蛋白的还原形式角朊酸。角质层是保护头发内蛋白质的多层膜，在碱性状态下容易抬升，在pH值为10到13的高碱性条件下，NH3+和COO-基团之间的离子相互作用首先减弱，导致二硫键断裂，角蛋白结构部分展开，还原剂更容易接触到角蛋白。 近年来最广泛使用的试剂之一是由Nakamura等人建立的Shindai溶液，它由25 M M Tris HCl、2.6 M硫脲、5 M尿素和5%（v/v）2-巯基乙醇组成。尿素和硫脲主要作用是使头发纤维中氢键断裂，并最终促进还原剂容易地与角蛋白分子的二硫键结合。加入2-巯基乙醇，通过其硫代阴離子的反应来破坏二硫键，加入三盐酸，以调节到最佳的pH环境。一般来说，在氢氧根离子存在下，二硫键很容易在高pH下水解，但在pH 10以上的碱性条件会引起肽链的破坏。

5人发角蛋白生物材料的生物医学应用

利用天然衍生的生物材料，如胶原蛋白、透明质酸、明胶、海藻酸钠和壳聚糖，已经在生物医学材料的开发中进行广泛的研究。近年来，人发角蛋白因其良好的生物相容性、生物降解性以及细胞整合素与角蛋白分子内特定氨基酸序列之间良好的细胞相互作用而受到生物医学工程领域的广泛关注。角蛋白在生物医学应用中最显著的优点之一是它可以从人的头发等来源中提取，植入后可能引起非常低的免疫反应。角蛋白已经被制备成各种生物材料支架，如薄膜和水凝胶;其他支架可以通过角蛋白和聚合物的混合来制备。基于角蛋白的生物材料已被用于多种生物医学应用，包括用于周围神经再生的神经导管填料、用于伤口愈合的水凝胶或薄膜、止血剂和用于组织再生的其他形式。人发角蛋白由于其高半胱氨酸残基含量，具有自发的自组装和聚合特性，可以制备各种生物材料，如薄膜、水凝胶和大孔支架，其良好的细胞相互作用和生物相容性，特别是人发角蛋白由于基于人源蛋白质，所以具有低免疫原性，使其在再生医学上将会有更广泛的应用。人发角蛋白的生物医学应用的深度和广度，一方面是要设计促进组织再生的功能性生物材料，需要进一步研究其与细胞间的相互作用;另一方面是要研究控制和增强人发角蛋白为基础的生物材料的机械强度，使其能在硬组织再生中得到应用。随着有效提取角蛋白方法效率的进一步提高，能够开发出适合于更多特定生物医学应用场景，具有适当生物相容性和机械特性的角蛋白基生物材料，使角蛋白生物材料的医学应用前景更加广阔。

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