百日菊白粉菌的分子检测与鉴定

刘闰 周暄 邢帅

摘要：对百日上的白粉菌进行分子生物学分析，采用试剂盒法提取病原菌总基因组DNA，PCR扩增其rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）的保守序列并测序，并通过Clustal与MEAG软件构建系统发育树推演系统进化关系，在分子水平鉴定该菌种并比较与其他白粉菌菌种的亲缘关系。结果表明，本研究测序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列与发生在土耳其菊芋上的Erysiphe cichoracearum（KF453969.1）相似度达到99%，与其具有比较近的亲缘关系。以百日菊白粉菌为研究对象，在分子水平鉴定该菌种并分析其进化亲缘关系为本试验的创新之处。

关键词：百日菊;白粉菌;内转录间隔区;序列分析

中图分类号：S435.672  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0098-06

百日菊（Zinnia elegans Jacq.）别称百日草，为中药材，以全草入药。百日菊也是一年生草花主栽品种之一，其色彩丰富，花大、艳丽，花期长达百日，故得百日菊之美名。白粉病是百日菊常见的最重要病害之一，在生长区几乎每年都普遍发生[1-3]。百日菊被白粉菌侵染后，最初叶片出现白色粉状斑点，后病斑扩大或相连成片，发病后期叶面布满白色粉层，叶片变褐，严重影响观赏价值，甚至导致植株成片死亡。发病后期在发病部位形成的小黑点即为病菌的闭囊壳。据以前的研究报道有2个属的白粉菌引起百日菊的白粉病，分别是白粉菌属（Erysiphe）和单丝壳属（Sphaerotheca），属于子囊菌门（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae）[4-7]。

白粉菌传统的鉴定以其形态学为主要特征，如有性世代闭囊壳内子囊的个数及子囊孢子的数目，闭囊壳外附属丝的特征等，但传统的分类特征有诸多不足之处[8-11]。近年来，分子生物学在植物病害鉴定上的应用越来越广泛，特别是植物病原菌在rDNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）既具有保守性，又在科、属、种水平上均有特异性序列的特点，通过特异性引物对ITS区段进行PCR扩增，可用于快速鉴定、检测植物病原菌以及病害的诊断等[12-13]。目前国内关于百日菊白粉病病原菌分子分类系统的研究未见报道，通过提取百日菊白粉菌总基因组DNA，利用分子生物学技术对其分类特征及进化关系进行研究，可为该花卉白粉病的准确调查提供有效和实用的手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白粉菌样本于2017年8月12日采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学城市实验林场，样品编号为BC180623，寄主植物为百日菊。提取白粉菌基因组DNA的试剂盒购自盛泽生物试剂有限公司（目录号：DP321）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品白粉菌的收集 刀片轻轻刮下叶片表面的菌丝与闭囊壳混合物，放入2 mL离心管中，置于-4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 基因组DNA的提取 采用试剂盒法提取百日菊白粉菌基因组DNA：（1）取适量白粉菌菌丝放入研钵中，加入液氮充分研磨;（2）加入400 μL缓冲液FP1和6 μLRNaseA（10 mg/mL），涡旋振荡 1 min，室温放置10 min;（3）加入130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min，12 000 r/min离心 5 min，将上清液转移至新的离心管中，重复这一步骤;（4）向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时出现絮状基因组DNA，离心2 min，弃上清，保留沉淀;（5）加入700 μL 70%乙醇，涡旋振荡5 s，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复这一步骤;（6）开盖倒置，室温晾干10 min，彻底晾干残余的乙醇;（7）加入适量洗脱缓冲液TE，65 ℃水浴 10～60 min溶解DNA，期间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。用琼脂糖凝胶电泳方法检测得到的DNA溶液。

1.2.3 ITS序列PCR扩增 PCR反应的引物采用通用引物ITS1、ITS4[1，13]，PCR反应所用的试剂是PCR Mix。25 μL的反应体系如下：模板DNA 1 μL;PCR Mix 12 μL;ddH2O 10 μL;P1和P2分别为 1 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循环;72 ℃最终延伸10 min。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察，检测合格样品进行序列测定与分析。

1.2.5 序列分析 将所得DNA序列输入GenBank进行BLAST比对检索，从NCBI数据库中调取22种白粉菌ITS保守序列，采用Clustalx1.83将测序白粉菌（BC180623）结果与不同白粉菌的ITS序列构建系统发育树，推演系统进化关系。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取与PCR扩增的结果

ITS通用引物扩增获得的目的片段用胶回收试剂盒回收并纯化，对所得结果进行电泳检测（图1），PCR扩增产物在回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序获得长度为603 bp的碱基序列，结果如下：2.3 百日菊白粉菌ITS序列进化樹构建结果与分析

获得的序列用NCBI的BLAST进行序列搜索，从GenBank中选取部分植物白粉菌ITS序列与本试验测序结果进行比较分析（表1）。对表1白粉菌的ITS序列对比分析结果见图2。

由图2可知，样品百日菌白粉菌BC180623的ITS序列与KF453969.1的ITS序列最为接近，相似度达到99%。两者序列差异性主要体现在第2、4、19、560、581、585位碱基上。说明样品百日菊白粉菌与KF453969.1具有较近的亲缘关系。此外，23种白粉菌ITS序列219 ～374 bp之间保留着较高的一致性，因此，这些区段有可能起到了保障白粉菌性状稳定遗传的功能。