石榴同源四倍体诱导及评价

潘宏兵，罗 玲，冯 娟，李贵利，杜 邦，黄 云

(1.攀枝花市农林科学研究院，四川 攀枝花 617061； 2.四川省农业科学研究院 园艺研究所，四川 成都 611130； 3.四川省农业广播电视学校 攀枝花市中心分校，四川 攀枝花 617000)

石榴(PunicagranatumL.)原产中亚地区，在世界热带、亚热带区域广泛栽培，引入国内栽培有2 000多年历史，已保存石榴品种类型280余个[1]。目前，石榴新品种选育较多采用杂交、芽变、辐射诱变和实生选育，存在育种周期长、效率低和目标性状不确定等问题。而倍性育种操作简单，不受季节和环境等条件限制，且培育出的多倍体通常具果实大、品质好、抗逆性强及适应性广等优点，已成为果树种质创新和新品种选育的一种重要育种方法[2]。多倍体自然发生主要通过自然芽变和实生种子筛选途径获得，例如鸭梨品种天海[3]、葡萄品种红太阳[4]等四倍体由自然芽变选育而来，而枳品种灌云1号[5]、枇杷品种B431[6]四倍体由实生种子筛选获得。多倍体人工诱导主要通过物理、生物和化学诱变途径获得，例如SMITH等[7]用γ射线照射小种矮型香蕉品种获得了其突变型四倍体，通过原生质体融合、配子染色体加倍、胚乳培养、有性杂交等技术在猕猴桃[8]、柑橘[9]、苹果[10]、枇杷[11]、香蕉[12]、枣[13]等植物上获得了多倍体，通过秋水仙素或氨磺乐灵诱导种子、芽、愈伤组织在枣[14]、蓖麻[15]、草莓[16]、柑橘[17]、罗汉果[18]、欧李[19]、石榴[20]等植物上获得了多倍体，其中石榴多倍体为四倍体月季石榴，是观赏石榴品种，未见作为果树栽培石榴品种的多倍体诱导研究报道。石榴优良品种少制约了产业进一步发展。鉴于此，开展秋水仙素诱导石榴种子研究，对诱变材料进行倍性鉴定、植物学性状评价和农艺性状评价，旨在筛选出具有特异优良性状的育种材料，加快石榴优良新品种选育。

1 材料和方法

1.1 试验材料

紫美石榴曾用名以色列软籽酸，该品种于1996年从以色列引入四川攀枝花市试种，2015年通过四川省农作物品种审定(川审果2015010)。2013年进行紫美自交授粉，同年10月取其自交种子作为四倍体诱导材料。

1.2 试验设计

取催芽萌动紫美石榴种子，用0.3%秋水仙素溶液(含1%二甲基亚砜)浸渍处理。浸渍时间设CK(0 h)、A1(12 h)、A2(24 h)和A3(36 h)4个处理，每处理60粒种子，重复3次。30 d统计成活率，90 d统计诱导率。

1.3 倍性鉴定

植株流式细胞仪倍性检测参考王艳等[21]的方法，检测仪器用德国Partce公司的CyFlow®Ploidy Analyser。植株细胞染色体制片参考冷青云等[22]的方法，通过电子显微镜观察拍照计数染色体数目。

1.4 植物学性状、农艺性状评价

2017年春季，在仁和区大田镇石榴基地的会理青皮软籽石榴树上分别高接二倍体、四倍体紫美石榴各15株。2018—2019年，调查叶长、叶宽、叶形指数、叶厚、叶柄粗、叶面积、叶绿素含量、完全花长、完全花宽、花形指数、完全花雄蕊数、子房心室数、百粒质量、籽粒硬度、可溶性固形物含量、果皮厚、果皮颜色、籽粒颜色，观察叶片气孔特征和叶截面细胞组织结构，观察植株生长势、主干颜色和主干纵列深浅，观察萌芽期、始花期、成熟期和落叶期物候期。叶面积测量选用YMJ-CH叶面积仪，叶绿素含量测定选用SPAD-502 Plus叶绿素测定仪，叶片气孔特征观察采用指甲油印迹法，叶肉组织结构观测用徒手切片。

1.5 数据处理

用Excel 2016和SAS 9.3进行数据整理和分析。

2 结果与分析

2.1 石榴四倍体植株的鉴定

叶片单细胞DNA含量经流式细胞仪检测结果见图1，对照二倍体植株在荧光强度16 384处出现峰值(图1A)，诱变植株在荧光强度32 768处出现峰值(图1B)，诱变植株峰值出现的荧光强度是二倍体植株的2倍。染色体计数观察结果表明，对照二倍体植株根尖细胞染色体数为2n=2x=16(图2A)，诱变植株为2n=4x=32(图2B)。通过流式细胞仪检测和染色体数目观察，确定诱变植株为紫美石榴同源四倍体。

A:二倍体;B:四倍体 A:Diploid;B:Tetraploid

2.2 秋水仙素诱导处理石榴种子结果

秋水仙素诱导石榴种子结果见表1。秋水仙素处理种子时间延长，其对种子的毒害性增大，种子成活率降低。CK成活率最高，为87.78%，其次是A1和A2处理，A3处理成活率最低，为67.22%。A2处理诱导四倍体效果最好，四倍体诱导率为1.11%，其次为A1处理，CK和A3处理未诱导出四倍体苗。试验获得纯合四倍体3株，同时获得部分嵌合体植株。

表1 秋水仙素诱导石榴种子结果

2.3 石榴二倍体、四倍体叶片气孔比较

多倍体典型特征是叶片气孔变大。从表2可以看出，四倍体紫美石榴叶片气孔长25.79 μm、宽16.79 μm，均极显著大于二倍体，而气孔密度为78.40个/mm2，极显著低于二倍体。从图3可以看出，紫美石榴的四倍体叶片气孔明显比其二倍体大。

表2 石榴二倍体、四倍体叶片气孔特征

注：数据采用平均值±标准差表示，**表示t检测在P<0.01水平上的差异显著性，下同。

Note：Data are average value ± standard deviation,** indicates the significance of difference byt-test at the level ofP<0.01,the same below.

A:二倍体;B:四倍体 A:Diploid;B:Tetraploid

2.4 石榴二倍体、四倍体枝叶性状比较

从图4可以看出，四倍体与二倍体相比较，叶片变大、网状叶脉更明显、叶色更深，四倍体叶片的栅栏组织和海绵组织比二倍体大。从图5可以看出，二倍体、四倍体植株生长势差异不明显，四倍体主干颜色明显浅于二倍体，四倍体主干纵裂深浅比二倍体更明显。

从表3可知，四倍体叶片的叶长、叶宽、叶厚、叶柄粗、叶面积以及叶绿素含量均极显著高于二倍体，仅叶形指数极显著低于二倍体。其中，四倍体叶面积为1 123.13 mm2，比二倍体大12.8%；四倍体叶绿素含量(SPAD) 为68.80，比二倍体高出15.8%。叶面积大和叶绿素含量高有利于四倍体提高光合效率，积累更多碳水化合物。

图4 石榴二倍体、四倍体叶片

图5 石榴二倍体、四倍体枝条

表3 石榴二倍体、四倍体叶片性状比较

2.5 石榴二倍体、四倍体花和果实性状比较

图6为二倍体、四倍体花和果实形态，两者的花和果实形态差异明显。四倍体花比二倍体大，主要是花托、萼筒和萼片增大，四倍体完全花的胚珠、雌蕊和雄蕊比二倍体大。二倍体、四倍体果实均为近圆球形，果皮颜色均为深红色。四倍体果皮比二倍体厚，籽粒颜色比二倍体浅，籽粒略比二倍体大。

由表4可知，四倍体的完全花宽极显著高于二倍体，而完全花长、花形指数、完全花雄蕊数、子房心室数均极显著低于二倍体，其中，完全花雄蕊数为165.7个，比二倍体少35.0%；子房心室数为7.4个，比二倍体少26.7%。

由表5可知，四倍体的果皮厚和百粒质量均极显著高于二倍体，四倍体果皮厚为0.80 cm，比二倍体果皮厚近2倍；四倍体可溶性固形物含量显著低于二倍体，比二倍体降低1.03个百分点；四倍体籽粒为硬籽，籽粒硬度高于二倍体(半软籽)。

2.6 石榴二倍体、四倍体物候期比较

在四川攀西石榴产区，四倍体紫美石榴的物候期晚于二倍体(表6)，四倍体的萌芽期较二倍体晚1周多，始花期较二倍体晚近半个月，成熟期较二倍体晚近半个月，落叶期较二倍体晚近半个月。四倍体紫美石榴花期延后，对避开南方花期倒春寒有利，其成熟期在10月上中旬，能延长石榴产期。

图6 石榴二倍体、四倍体的花和果实

表4 石榴二倍体、四倍体花的性状比较

表5 石榴二倍体、四倍体果实的性状比较

表6 石榴二倍体、四倍体物候期比较

3 结论与讨论

秋水仙素多被用于诱导处理种子、芽、原球茎、愈伤、子房等以获得多倍体材料，是诱导植物染色体加倍的最有效药剂之一[23]。SHAO等[20]分别用含0.001%秋水仙素固体培养基和0.5%秋水仙素液体培养基诱导月季石榴外植体，均获得四倍体植株。本研究发现，用0.3%的秋水仙素浸渍处理萌动紫美石榴种子24 h效果最好，四倍体诱导率为1.11%，表明用秋水仙素处理石榴种子诱导多倍体方法可行，秋水仙素使用浓度与诱导处理材料类型紧密相关。而刘丽[24]研究表明，利用秋水仙素诱导处理发芽率达30%的大籽石榴种子，以0.2%秋水仙素处理48 h促进种子胚轴横径、幼苗冠幅和株高等生长效果明显，但未能获得多倍体植株，这可能与秋水仙素浸泡处理时石榴种子的萌发状态有关，种子催芽萌发进程存在个体差异，需要进一步筛选适宜的诱导时期。

多倍体植物叶绿素含量较高[25]，气孔增大和气孔密度下降[26]，在四倍体紫美石榴上表现相同。多倍体植物通常具有细胞大、器官大、适应性强等特性[27]，本研究获得的四倍体紫美石榴的大部分叶、花、果实性状极显著优于二倍体，仅叶形指数、完全花长、花形指数、完全花雄蕊数及子房心室数极显著低于二倍体，可溶性固形物含量、籽粒颜色以及籽粒硬度表现差于二倍体。可能是加倍后调控子房心室数、籽粒颜色和籽粒硬度等性状的基因沉默或下调，李晓荣等[28]研究不同倍性甘蓝型油菜基因转录表达时发现，80%的基因表现为非加性表达，某些基因在多倍体中表达沉默，也可能是基因表达与植物种类相关同时还受到环境互作的影响。有研究认为，小孢子母细胞减数分裂行为异常引起多倍体植物花粉育性降低[6]，已经在四倍体萱草[29]、黄花菜[30]等多倍体植物研究中得到证实。四倍体月季石榴花粉萌发率显著低于二倍体[20]，同样田间观察发现四倍体紫美石榴结实率低于二倍体，可能是花粉育性降低引起的。四倍体紫美石榴物候期晚于二倍体，相关多倍体植物物候期研究报道较少，其抗逆性增强是否与物候期改变有关有待研究。四倍体紫美石榴花期延后，对避开南方花期倒春寒有利。

综上所述，秋水仙素诱导石榴种子能获得同源四倍体，其植物学性状和农艺性状与二倍体相比较差异明显，可作为育种新材料开展相关评价利用研究。