基于重测序技术筛选工作犬OR 基因SNP 位点

高一龙 贺星亮 温 海 宋珍华 秦海斌 包喜军 李 刚 孙 勇

鉴于犬的嗅觉能力突出，各国警方广泛应用训练有素的工作犬搜查爆炸物、毒品等违禁品打击和预防犯罪。工作犬的嗅探能力从根本上讲是受犬嗅觉受体(Olfactory receptor，OR)基因调控的，因此如果能够运用分子生物学技术开展工作犬嗅探能力与OR 基因之间的关联性研究工作，发现主要的分子标记来挑选嗅觉灵敏的受训犬，可以显著提高工作犬的训成率。目前科研人员对犬OR 基因的研究主要集中在基因组成结构、分类分布和多态性等方面，很少有人对犬OR 基因多态性与嗅探能力之间的关联性进行研究。

在本研究工作中，以警用工作犬种(德国牧羊犬、拉布拉多犬和史宾格犬)作为模型动物，拟从犬的嗅觉受体基因组中选择10 个OR 功能基因作为候选基因，测序比对分析研究犬嗅觉受体(OR)基因的多态性， 为下一步筛选工作犬OR 基因的主效SNP 位点奠定基础。

一、材料

（一）试验动物

某警犬基地培训的工作犬99 头，其中史宾格犬43头（公23 头，母20 头）、拉布拉多犬39 头（公24 头，母15 头）和德国牧羊犬17 头（公10 头，母7 头）。这些犬是三代以内没有直接血统关系的，体质健康且经过实战检验的嗅探犬。

一犬一舍（4×4m2），犬舍屋顶有隔热层，独立的户外运动场（15×6m2）。采用标准的干燥颗粒饲料（福斯牌犬粮）进行定时定量的饲喂，自由饮水，每日适度散放、运动，定时训练，全程兽医监控健康保障。

（二）主要试验仪器

1.PTC-200 PCR 仪，美国BIO-RAD 公司；2.System electrophoresis Mupid 电泳槽，日本TAKARA 公司；3.Bio-Rad CHEMI DOC 凝胶成像分析系统，美国；4.Centrifuge 5810R 高速低温冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；5.AstraGene AstraNet 紫外分光光度计，英国；6.ABI 3730XL 型DNA 测序仪，美国Applied Biosystems。

（三）主要试剂

1.血液基因组DNA 提取试剂盒(离心柱型)；2.蛋白酶K；3.Ex Taq DNA 聚合酶；4.FG，3130 POP-7TM Polymer、FG，HI-DI FORMAMIDE 25mL BOTTLE 和FG，BUFFER (10X) WITH EDTA 25ML 等测序所有试剂；5.引物合成。

二、方法

表 1 挑选的OR 基因信息

表 2 PCR 扩增反应体系及PCR 扩增反应条件

（一）血样采集

由具备资格的操作熟练的兽医，对所有试验犬使用一次性真空EDTA 抗凝采血管颈静脉采血，每头2～5mL，送至实验室-20℃冰箱保存。

（二）犬基因组DNA 提取与检测

样本的基因组DNA，使用血液基因组DNA 提取试剂盒自行提取。将提取的DNA 溶液置于-20℃长期保存。取基因组DNA 样 本2μL， 用AstraGene AstraNet 紫外分光光度计测定其浓度和OD 值，要求合格的DNA 样品浓度须大于50ng／μL，OD260／OD280 在1.6 ～2.0之间，OD260／OD230 在1.8～2.1之间。

（三）嗅觉受体（OR）基因的筛选

从数目众多的犬嗅觉受体超级基因家族中，随机挑选出10 个具有完整阅读框（ORF）的犬嗅觉受体基因(cOR)： cOR52AC1、cOR9S13 、c O R 9 Q 13、C f O R 0 5 2 5、C f O R 0 0 1 5、C f O R 0 0 0 4、CfOR0006、CfOR0055、CfOR0149和 CfOR0192，详见表2。重叠群（contig）和具体序列信息可从 (http://dogs.genouest.org/ORrepertoire.html ) 和NCBI 数据 库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找获取。

(四）引物设计

根据查找到的OR 基因参考序列，设计OR 基因PCR 扩增和测序成对引物的设计，可采用软件Primer Premier 3.0 进行设计引物。OR 基因引物具体序列和测序引物序列信息略。

（五）聚合酶链反应（PCR）、测序和序列分析

1.聚合酶链反应（PCR）

采用PTC-200 热循环仪进行PCR 反应，30μL 反应体系及反应条件见表4取PCR 产物，用经EB 染色的1%琼脂糖凝胶水平电泳，100mA/cm，120V 电泳1 小时。

2. PCR 产物纯化

按照Millipore 公司96 纯化板操作流程操作：向96 纯化板孔中加入100μL ddH2O，取出PCR 产物至96纯化板中室温静置10 分钟，真空抽滤泵10 分钟抽干，向96 孔纯化板中加入40μL ddH2O，室温溶解10 分钟，取出对应的孔中的纯化产物至另一96 孔PCR 板中。提取纯化目的条带DNA，此步骤对于保证测序的高精确性至关重要。

3.测序

将提纯好的目的条带DNA，交给基因公司测序。

4.序列分析

测序序列，采用Phred 等软件进行分析。在Linux系统下利用Phred/prap/consed 软件进行序列的分析和基因频率的统计。

三、结果与分析

（一）PCR 扩增产物结果

经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 扩增目的产物条带单一特异性强，DNA 条带清晰透亮，产物的大小符合预期结果，具体见图2。

（二）测序结果

图2 电泳抽检胶图

1.测序峰图

除COR9S13 基因以外，其他9 个OR 基因都能顺利测序。而COR9S13 基因由于片段较长（1634bp），且在部分样本中有1 至多个poly 结构，经不断优化实验条件，最终有50 个样品经3 个测序反应可以测通，各个OR 基因测序图略。

2.测序分析比对结果

对99 个样本的10 个OR 基因测序数据，分析比对后发现总共有67 个SNP 位点:

其中CfOR0006 基因有12 个SNP 位点、CfOR0004基因有9 个SNP 位点、CfOR0015 基因有5 个SNP 位点、CfOR0055 基因有8 个SNP 位点、CfOR0149 基因有3 个SNP 位点、CfOR0192 基因有3 个SNP 位点、CfOR0525基因有4 个SNP 位点、COR9S13 基因有8 个SNP 位点、COR52AC1 基因有10 个SNP 位点、OR10H08 基因有5 个SNP 位点。

（三）SNP 最小等位基因频率（MAF）

NCHROBS：染色体数目，即样本数X2；DM：德牧，LD：拉多，SBG：史宾格，All：所有样本。

MAF（最小等位基因频率）是指一个突变位点的最小突变频率，越大当然越好，通常认为一个位点的MAF＞0.05 才有研究的意义，如果满足不了0.05 的话，说明这个位点的突变频率很低，那么除非实验的标本量很大有好几千，否则做实验过程中很有可能无法做出突变基因。通过MAF 计算标本量，也就是尽量去避免因为标本量不够而做不出突变。

为了在下一步的群体SNP 检测实验中，从有限的样本群体中检测出有意义的突变，我们设立了SNP 位点的MAF＞0.1 的过滤标准，由表3 可以看出，满足MAF＞0.1条件的SNP 位点有40 个，其中有31个SNP 位点为首次发现。

四、结论

本研究采用目标区域基因重测序技术，以Canfam 2.0 基因组为参照，通过软件分析比对，研究了犬OR 基因的多态性，对发现的OR 基因的SNP 位点的基因频率、基因型频率进行了统计。结果共发现工作犬OR 基因SNP位点67 个，对所有的SNP 根据MAF ＞0.1 过滤，共得到高一致性的群体SNP 位点40 个，其中有31个SNP 位点为首次发现。

表 3 SNP 最小等位基因频率

备注：MAF：最小等位基因频率，minor allele frequency；

本研究筛选出来的31个SNP 位点，可以为下一步开展工作犬OR 基因群体SNP 检测分型实验研究，分析不同SNP 基因型与工作犬嗅觉探测能力之间的关联性，寻找与犬嗅探能力相关的分子标记位点奠定研究基础。