检测与诊断技术要点（第二版）（上）

1 概述

1.1 病原特性 非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种有囊膜的DNA 病毒，是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。ASFV 粒子直径约为200 纳米，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是基因组DNA、基质层、内膜、核衣壳和外囊膜。首次发现的传入我国的ASFV毒株属于基因II型。ASFV的衣壳蛋白p72，膜蛋白p54、p30 和p12 具有良好的抗原性。ASFV 耐受酸碱的范围较广，pH 值4～10 条件下在无血清的培养基中保持稳定，但在pH值低于4或高于11.5时数分钟内可被灭活。ASFV 对环境的抵抗力很强，在低温条件下可存活数年。ASFV对热的抵抗力较弱，60 ℃20 min 或56 ℃70 min 可被灭活。一般的消毒措施均可有效杀灭ASFV。最有效的消毒剂是去污剂、次氯酸盐、碱类及戊二醛。

1.2 传染源 带非洲猪瘟病毒的野猪和发病家猪的分泌物及排泄物，含有病死猪组织或非洲猪瘟病毒污染的泔水，含非洲猪瘟病毒的猪肉及其制品，以及钝缘软蜱。

1.3 传播途径 感染猪与健康易感猪的直接接触可传播非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒可通过饲喂污染的泔水、污染的饲料、垫草、车辆、设备、衣物等间接传播。钝缘蜱属的软蜱，特别是O.moubata（非洲）和O.erraticus（欧洲）是ASFV 的宿主和传播媒介。消化道和呼吸道是最主要的感染途径。

1.4 易感动物 家猪和野猪。其他哺乳动物包括人类均不感染非洲猪瘟病毒。目前报道的发病猪群主要是饲喂了被非洲猪瘟病毒污染的泔水。不同品种、日龄和性别的猪均对非洲猪瘟病毒易感。

1.5 潜伏期 家猪为3～19 d不等。

1.6 临床症状 非洲猪瘟是能引起不同品系、不同年龄家猪和野猪一系列综合征的疾病。急性猪瘟表现为高烧、网状内皮系统出血，死亡率高。ASFV 有强毒力、中等毒力和低毒力三种类型毒株。临床上可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。

1.6.1 最急性型 发病猪体温达41～42 ℃，呈现厌食、食欲废绝、精神沉郁、皮肤充血等症状，1～4 d 内死亡。也有无症状死亡的猪。发病率和病死率均可达100%。

1.6.2 急性型 发病猪体温达40～42 ℃，呈现厌食、不愿活动、皮肤发红、呕吐、鼻腔出血、血便、便秘等。妊娠母猪流产。病死率可达90%～100%。

1.6.3 亚急性型 与急性型类似。病猪出现中度发热，食欲下降。皮肤出血和水肿，感染后7～20 d死亡，病死率为30%～70%。

1.6.4 慢性型 病猪体重下降、生长不良，呈现间歇热，耳部、腹部和大腿内侧皮肤发生坏死或溃疡，关节肿大，感染猪可出现呼吸道症状。

1.7 实验室诊断 ASF 的实验室诊断分为病原学诊断（包含病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的检测）和抗体检测。依据地区或国家的疾病情况及诊断实验室的能力选择合适的诊断方法。

1.7.1 鉴定病原 国家法定实验室诊断必须进行猪原代巨噬细胞或骨髓培养接种分离病毒，用荧光抗体试验（FAT）检测组织涂片或冷冻切片中的抗原，用PCR方法检测基因组DNA。PCR是一种优良的、灵敏的、快速的ASFV 检测技术，在很多情况下都是非常有用的。特别是组织不适合病毒分离和抗原检测的情况。

在可疑病例中，病料在猪原代巨噬细胞培养物中传代，并重复上述过程。

1.7.2 血清学试验 耐受过ASF 自然感染的猪通常在感染后7～10 d产生抗ASFV抗体，这些抗体能持续很长一段时间。若疾病呈地方性流行，或者是由低毒力毒株引起的最初的暴发，对于新暴发的研究需要对送检的血清中的特殊抗体和组织渗出液进行检测。很多方法如间接荧光抗体（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹试验均可用于抗体检测。

2 早期发现

为尽早发现ASF 疫情，首先要让猪场全体员工熟悉ASF 的临床症状。了解周边3 km 范围内的养猪场户、屠宰场点、生猪交易场所、无害化处理场等情况，密切关注周边生猪异常死亡情况，及时发现疫情隐患。

时刻关注本猪场各个环节的猪只异常情况，包括猪只的精神状态、采食情况、体温变化、体表变化和经产母猪表现等。目前我国大多数的ASFV 感染病例属于急性-亚急性。通常，ASF 急性-亚急性的症状主要包括：发烧、昏睡、厌食、皮肤出血以及循环系统、呼吸系统、消化系统出现问题并伴有神经失调。

2.1 看精神状态 及时发现栏舍内眼神异常的猪只（这时猪只可能还未排毒）、精神沉郁的猪只，并及时采样和送检。猪场要积极发动一线员工关注异常猪只，对于提前发现猪只异常并及时采样经实验室检测阳性的，给予相应奖励。

2.2 观察采食情况 关注群体和个体猪只的采食情况，对于采食量稍微减少的（排除饲料因素），要尽快采样送检。采食量明显下降的猪只一般会伴随着体温升高。

2.3 监测体温变化 正常保育猪、育肥猪的体温一般在39～40 ℃之间；正常成年基础猪群的体温在38～39 ℃之间（其中母猪发情、分娩前后几天，体温会升到39～40 ℃之间）。如果发现体温超过正常范围的猪只，应及时采样送检。为了防止测量体温时交叉污染，体温计必须一猪一换，须戴手套和穿防护服；可采用远红外体温计测温，尽量不入栏。

2.4 观体表变化 看到皮肤发红猪只，表明猪只处于发烧状态。另外，有些猪只打针时出现凝血不良。对于这些异常猪只，要及时采样检测。

2.5 看经产母猪的表现 经产母猪除上述临床表现外，还会出现流产。ASF 造成流产有别于其他疫病常见的黑胎或白胎，会出现胎儿均质发红。

一旦发现可疑症状，应第一时间采样送检。采样优先顺序如下：鼻腔拭子＞唾液＞阴门拭子＞肛门拭子。

3 现场排查

3.1 准备工作

3.1.1 人员准备 了解非洲猪瘟基本知识（基本的生物学特征、流行病学特点、临床表现、剖检病理变化等）。了解非洲猪瘟感染与传播的高风险因素（饲喂泔水、生物安全水平低、动物贩运、猪肉及其制品流通）。了解排查工作中需遵守的生物安全操作要求，避免人为造成传播。养殖户等相关人员可能面临较大压力，应注意工作方式方法。

3.1.2 车辆准备 车辆必须彻底清洗消毒。车辆不携带无关物品。在车内、车的后备箱里铺塑料布防止污染。

3.1.3 物品准备（生物安全防护及采样所需物品）

3.1.3.1 进场所需材料清单 胶靴；垃圾袋（包括生物危险品垃圾袋）；一次性生物安全防护服；自封袋（用来装手机或其他设备）；口罩；面部用消毒湿巾；鞋套或靴套；密封用胶带；一次性乳胶手套；护目镜；洗涤剂及刷子；消毒剂及喷壶（适用于非洲猪瘟病毒的消毒剂）。

3.1.3.2 采样所需材料清单 一般材料：标签和记号笔；数据记录表、笔、写字板；盛放针头和刀片的锐器盒；高压灭菌袋；用于环境采样的拭子和盛放拭子用的离心管。

样品包装运输所需材料：容器/离心管/小瓶（防漏并标示清楚）；吸水纸；密封性好的容器或袋子，作为二次包装（即防漏），用于储存动物样品的容器和采血管；冷藏箱（+4 ℃）；便携式-80 ℃冷冻箱/干冰/液氮罐（仅在远离设备齐全的实验室进行取样时才需要）；保定动物的材料（如套索、木板）。

采血所需材料：消毒剂和脱脂棉（酒精棉）；不含抗凝剂的无菌采血管（10 mL）（红色盖子）；含有EDTA的无菌采血管（10 mL）（紫色盖子）；根据猪的大小和采样部位（颈静脉、耳缘静脉）选取真空采血管或10～20 mL注射器。

3.2 进出养殖场要求

3.2.1 抵达养殖场 车辆停在养殖场入口附近，不要驶进场内。

在养殖场指定的地点（清洁区），穿戴个人防护设备（如需要，应遵循养殖场的要求进行个人防护），并进行物资准备、消毒剂制备等。

进入养殖场生产区域前，脱下和摘掉不必要的衣服和物品（夹克、领带、手表等），清空衣服口袋，按照养殖场进场程序（淋浴洗澡或其他方式）进入生产区域。电子设备（移动电话等）应放置在密封的塑料袋中，以便随后进行清洁和消毒。在养殖场内，只能通过塑料袋使用手机，不要从袋子里拿出。其他非一次性物品，应在消毒后进场。如需要，应按照养殖场物资进场程序进行消毒后进场。消毒工作要在清洁干燥的地面进行（最好是混凝土地面），应划分清洁区和非清洁区并保证界线清晰。

3.2.2 穿戴个人防护设备（在清洁区）

（1）脱下鞋子，并放在塑料布上。

（2）在遵守养殖场进场要求的前提下，部分场需要脱去全部个人衣服，洗澡后穿戴养殖场内部衣服方可进场。

（3）部分场可以首先穿戴一次性防护服，穿上靴子。戴手套，手套要用胶带封上。

（4）如果需要穿防水服，防水服应套在靴子外层。再戴一层手套，方便中间更换。

（5）靴套至少覆盖胶鞋底部和下部。

（6）进场前，戴口罩并仔细检查物品清单。

3.2.3 离场前准备

（1）在非清洁区域对接触过养殖场的所有物品进行清洗和消毒处理。

（2）对盛放样品容器的表面进行消毒，然后放在清洁区。

（3）脱下鞋套放入非清洁区的垃圾袋中，然后彻底擦洗靴子（特别是鞋底）。脱下手套并放入非清洁区的垃圾袋中。脱下一次性防护服并放入非清洁区的垃圾袋中。脱下靴子，对靴子进行消毒后放入清洁的袋子里。

（4）手和眼镜也必须进行消毒，并用消毒湿巾清洁脸部。

（5）进入生产区域的人员在指定区域沐浴更衣后方可离开。

（6）非一次性物品（胶靴等）和盛放样品的容器用双层袋盛放并用胶带封装。可穿回日常的鞋子。携带出养殖场的袋子需放在车辆内预先铺好的塑料布上。

（7）接触过样品或潜在污染的车辆，应进行重点清洗消毒。

（8）在离开可能受到污染的区域之前，清洁和消毒汽车的轮胎和表面。清除所有可见的污垢。不要忘记清理隐藏的区域，如车轮拱、轮胎板和汽车底部。清除所有污垢后，用消毒剂喷洒表面。

（9）处理车内所有垃圾并清理所有污垢（应妥善处理垃圾）。用浸有消毒剂的布擦拭方向盘、变速杆、踏板、手闸等。

3.2.4 离场后

（1）如家中没有饲养生猪，可以回家淋浴并彻底清洗头发，并将当天所穿衣服浸泡在消毒剂中30 min；如果家中饲养生猪，则应在其他地方沐浴、清洗。

（2）如果进入了疑似感染场，确诊前不应前往任何饲养生猪的场所。如果确认该场感染了非洲猪瘟，3 d内不应前往任何有猪的场所。

（3）再次对汽车内部和外部进行消毒。清除汽车上的所有塑料布，并妥善处理。

3.2.5 消毒剂选择

（1）非洲猪瘟病毒对热的抵抗力较弱，一般的消毒措施都可以将病毒杀灭，但是在感染病猪组织以及低温条件下病毒的存活时间可达6个月以上乃至数年。

（2）最有效的消毒剂是去污剂、次氯酸盐、碱类及戊二醛。

（3）8/1 000 的氢氧化钠（30 min）、2%～3%次氯酸盐氯（30 min）、3/1 000福尔马林（30 min）、3%邻苯基苯酚（30 min），均可灭活病毒。碱类（氢氧化钠、氢氧化钾等）、氯化物和酚化合物适用于建筑物、木质结构、水泥表面、车辆和相关设施设备的消毒，酒精和碘化物适用于人员消毒。

（4）不易消毒的设备放置在阳光下暴晒消毒。

3.3 临床诊断 非洲猪瘟病猪主要临床表现的差异较大，不易识别，但通常有以下几种或全部典型症状，包括高热、呕吐、腹泻或便秘，有的便血，虚弱、难以站立，体表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮肤呈红色、紫色或蓝色，有的咳嗽、呼吸困难，母猪流产，产死胎或弱胎。出现上述临床症状后，一般2～10 d 内死亡。剖检可见内脏多个器官组织出血，脾脏显著肿大，颜色变暗，质地变脆。部分首次发生非洲猪瘟的养殖场，猪群发病非常急，最急性型不表现任何症状而突然死亡，无特殊临床表现和剖检病变。

3.3.1 临床症状 根据其毒力，ASFV 分为三个主要类别：高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力毒株。ASF的临床表现形式从特急性（非常急）到无症状（不明显）不等。目前我国大多数的ASFV感染病例属于急性-亚急性。非洲猪瘟的特征通常是猪突然死亡、死前呈现体温升高。临床表现从感染7 d 之内急性死亡，到持续几周或几个月的慢性感染不等。

主要临床症状有：无症状突然死亡；发病率、病死率高；高热，体温升高至40.5～42 ℃；耳、四肢、腹背部皮肤有出血点、发绀；呕吐，腹泻或便秘，粪便带血；虚弱、步态僵直，不愿站立等；偶见眼、鼻有黏液脓性分泌物。

其他临床症状有：精神沉郁、食欲下降；呼吸困难，湿咳；关节疼痛、肿胀；妊娠母猪流产、产死胎或弱仔。

3.3.2 剖检病变 非洲猪瘟特征性剖检病变通常是可见多脏器出血。

最明显的剖检病变是：淋巴结（特别是胃肠和肾）增大、水肿以及整个淋巴结出血，形态类似于血块；脾脏显著肿大，一般情况下是正常脾的3～6倍，颜色变暗，质地变脆；肾脏表面有瘀点（斑点状出血）。

剖检变化还可能包括：皮下出血；心包积液和体腔积水、腹水；心脏表面（心外膜）、膀胱和肾脏（皮质和肾盂）有出血点；肺可能出现充血和瘀点，气管和支气管有泡沫，严重的有肺泡和间质性肺水肿；身体有瘀点、瘀斑（较大的出血），胃、小肠和大肠中过量的凝血；肝充血和胆囊出血。

（未完待续）