没食子酸对心肌梗死后心肌纤维化作用及机制

2020-06-01 02:42朴哲浩王天娇
中国实验诊断学 2020年5期
关键词:胶原纤维化试剂盒

朴哲浩,王天娇,金 丽,崔 燕

(1.温州医科大学附属第二医院 心血管内科,浙江 温州325000;2.中国医学科学院阜外医院深圳医院 心血管内科;3.吉林大学第二医院 心血管内科)

心肌梗死是临床上常见的急危重症,严重影响患者的寿命和生存质量。心肌纤维化是心肌梗死后主要的病理过程,可致心功能障碍、心律失常甚至猝死[1]。因此,有效预防、抑制和逆转心肌纤维化,对提高心肌梗死患者的生存率及改善预后起着重要的作用。然而,目前对于心肌梗死后心肌纤维化的具体机制尚不完全清楚,故缺乏有效的干预措施。既往研究表明,组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDACs)在心血管系统中起着重要作用,对心肌纤维化亦有调控作用[2-5]。本研究通过建立心肌梗死小鼠模型,探讨组蛋白去乙酰化酶在心肌纤维化中的作用及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选择8周龄SPF级CD-1雄性小鼠40只,体质量35-40 g。细胞实验:H9C2细胞株(韩国全南大学医院实验室提供)。

1.2 试剂和仪器

没食子酸(G7384)购自美国Sigma公司。心脏组织的总RNA分离试剂盒、TOP script RT Dry MIX 、SYBR Green PCR试剂盒。ANP鼠单克隆抗体、BNP 鼠单克隆抗体、Collagen Ⅰ鼠单克隆抗体、Fibronectin鼠单克隆抗体、MMP9鼠单克隆抗体、HDAC5鼠单克隆抗体;Masson 三色染色试剂盒,美国ABI 7500荧光定量PCR仪;微板紫外连续波长酶标仪;蛋白电泳仪(韩国全南大学医院实验室提供)。

1.3 方法

1.3.1动物造模、H9C2细胞实验分组及给药 ① 小鼠适应性饲养1 w后,所有小鼠腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥钠进行麻醉,仰卧位固定于鼠板,行气管插管,连接小动物呼吸机,左心耳下方2 mm处结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。其中,随机选取10只作为假手术组,假手术组只穿线不结扎。关闭胸腔,缝合,小鼠有自主呼吸后,关闭呼吸机,拔出气管。再将造模成功后的20只小鼠随机分为心肌梗死模型组及没食子酸干预组,各组10只。没食子酸干预组给予没食子酸(100 mg/kg/d) 腹腔注射,假手术组和心肌梗死模型组腹腔注射等体积生理盐水。连续给药2 W。② 将H9C2 细胞株置于正常培养箱中培养,选择对数生长期细胞,用胰酶细胞消化液制成细胞悬液,后将细胞接种到12孔板中,并分为:正常对照组、HDAC5过表达组、没食子酸干预组。正常对照组未转染任何质粒,过表达组为HDAC5质粒转染,没食子酸干预组经HDAC5质粒转染并给予没食子酸(药物浓度100 μM)。

1.3.2心功能指标检测 2 W 药物干预结束后,小鼠经50 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,使用Vivid S5型小动物超声绘制小鼠二维超声心动图进行心脏超声检测,获得各组M型超声心动图,记录小鼠左室收缩末内径(LVESD)和舒张末期内径(LVEDD),并计算左室短轴缩短分数(LVFS%)=(LVEDD-LVESD)×100/LVEDD。

1.3.3Western blotting检测心肌组织ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、HDAC4,HDAC5、HDAC7、HDAC9、MMP9、GAPDH 蛋白表达 80 mg心肌组织中加入500 μl细胞裂解液(20 mmol/L Tris pH 7.5,150 mmol/L NaCl,1% Nonidet P-40,0.5% Sodium Deoxycholate,1 mmol/L EDTA,0.1% SDS,用前加 100 μg/mL PMSF),充分匀浆后置于冰上裂解30 min。12 000×g 离心10 min,收集上清,加入5×SDS Loading buffer,100 ℃煮沸10 min。SDS-PAGE电泳,转膜。PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h,加入封闭液稀释的ANP(1∶1 000)、BNP(1∶1 000)、Collagen Ⅰ(1∶1 000)、Fibronectin (1∶1 000)、HDAC4 (1∶1 000)、 HDAC5(1∶1 000)、 HDAC7 (1∶1 000)、 HDAC9 (1∶1 000)、 MMP9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜。PBST 洗涤3 次,加入HRP标记的IgG二抗,室温孵育1 h,PBST洗涤3 次,ECL显影。

1.3.4RT-PCR检测 采用H9C2细胞总RNA提取试剂盒提取H9C2细胞总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取质量。采用RNA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。设计荧光定量PCR引物分别为:HDAC5 F:AGCACCTCTTCACCACAGGT R:GTCCCATAGAGCAGGGTGTG MMP9 F:GAAGGCAAACCCTGTGTGTT R:AGGAAGA-CGAAGGGGAAGAC GAPDH F:GCATGGCCTTCCGTGTTCCT R:CCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCAT 据荧光定量PCR试剂盒说明配制反应体系,设置荧光定量 PCR 反应程序为:95 ℃变性,30 s;58 ℃ 退火30 s;72 ℃延伸30 s,39 个循环,制作溶解曲线。反应结束后从仪器上读取MMP9 mRNA相对表达水平。

1.3.5Masson’s 染色检测心肌胶原含量 心肌组织用4%多聚甲醛固定过夜,石蜡包埋,切片,常规脱蜡至水,Weigert铁苏木素染色7 min,酸性乙醇分化10 s,蒸馏水冲洗。Masson蓝化液返蓝3 min,蒸馏水冲洗。丽春红品红染色8 min,弱酸工作液洗1 min,磷钼酸溶液洗2 min,弱酸工作液洗1 min。苯胺蓝染色2 min,弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脱水20 s,无水乙醇脱水3 次,每次20-30 s。二甲苯透明3 次,每次2 min。光学显微镜下随机选择5个视野,使用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件分析心肌纤维化程度。胶原容积分数(CVF)= 胶原纤维染色面积/组织切片总面积。

2 结果

2.1 没食子酸对心肌梗死小鼠心功能指标的影响

没食子酸明显改善心肌梗死后受损的心脏功能。结果如图1 所示,与假手术组比较,心肌梗死模型组小鼠LVEDD、LVESD显著升高,LVFS则显著降低(P<0.001)。而没食子酸干预组与心肌梗死组比较,没食子酸干预组小鼠LVEDD、LVESD显著降低,LVFS显著升高(P<0.001)。

图1 超声心动图观察心肌梗死后心功能

2.2 没食子酸对心肌梗死小鼠心肌组织胶原含量的影响

没食子酸对心肌梗死后心肌纤维化有明显抑制作用。结果如图2 所示,假手术组小鼠细胞排列规整,少量胶原纤维(蓝色)散在分布;心肌梗死模型组小鼠有大量胶原纤维增生且分布杂乱;没食子酸干预组胶原纤维增生程度较心肌梗死模型组明显降低。心肌梗死模型组小鼠心肌组织CVF 显著高于假手术组, 没食子酸干预组较心肌梗死模型组CVF显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。

图2 Masson 染色观察心肌胶原含量

2.3 没食子酸对心肌梗死小鼠心衰标记物、心肌纤维化标记物、组蛋白去乙酰化酶、基质金属蛋白酶表达的影响

没食子酸降低心肌梗死后心力衰竭标记物及纤维化标记物基因的表达。结果如图 3所示,与假手术组比较,心肌梗死模型组心肌组织ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、HDAC5、MMP9 蛋白表达均显著升高。而没食子酸干预组与心肌梗死模型组比较,没食子酸干预组心肌组织ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、 HDAC5、MMP9蛋白表达显著降低。

2.4 没食子酸对过表达HDAC5心肌细胞中MMP9蛋白及mRNA表达的影响

结果如图4 所示,与正常对照组比较,HDAC5过表达组MMP9蛋白及mRNA均显著升高。而没食子酸干预组与HDAC5过表达组比较,没食子酸干预组MMP9蛋白及mRNA均显著降低(P<0.001)。

图3 检测心肌组织心力衰竭标记物、纤维化标记物、HDAC、MMP蛋白表达水平

图4 检测HDAC5过表达时MMP9蛋白及m RNA 变化

3 讨论

虽然介入、药物等治疗手段已在冠心病患者中广泛应用,但目前我国心肌梗死的发病率及死亡率仍呈逐年上升趋势[6]。心肌梗死发生后,心肌细胞缺血缺氧、神经-体液等因素异常激活,引起心室负荷过重、心室重构,所致心肌梗死后的心力衰竭是造成病死率居高不下的一个重要原因。心肌纤维化是心肌梗死后心室重构的主要病理基础,研究表明,多种细胞因子参与了该过程,包括:炎症反应、细胞凋亡、细胞信号调节等[7],但具体的病理生理机制目前仍不明确。而没食子酸的出现为解决上述问题提供了新的思路。

没食子酸亦称“五倍子酸”、“棓酸”,学名“3,4,5-三羟基苯甲酸”,分子式C7H6O5,广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中,是自然界存在的一种多酚类化合物。既往研究显示没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗自由基等多种生物学活性[8],研究中亦发现没食子酸可显著改善肺纤维化[9]。本研究通过比较没食子酸给药前后心肌梗死小鼠的心功能参数、心肌组织病理形态变化及心肌纤维化相关指标的变化,探究没食子酸在心肌梗死中对心肌纤维化的抑制作用,及其与HDAC5信号通路的关系。

众所周知,心肌纤维化作为心脏功能减退的病理基础,以成纤维细胞增殖、胶原累积或细胞外基质沉积为特征,最终引发心力衰竭甚至死亡[10,11]。本研究结果显示,与假手术组比较,心肌梗死模型组小鼠LVEDD 和LVESD 升高,LVFS降低,心肌胶原含量显著升高,提示心肌梗死心功能受到严重影响。使用没食子酸干预后,与心肌梗死模型组比较,小鼠LVEDD和LVESD 降低,LVFS升高,心肌胶原含量显著减少,显示心功能得到改善。另外,与假手术组比较,心肌梗死模型组小鼠心力衰竭及心肌纤维化标记物ANP,BNP,Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白水平明显升高,没食子酸干预后ANP,BNP,Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白水平较心肌梗死模型组明显下降。以上结果显示,没食子酸对心肌梗死后心力衰竭、心肌纤维化有明显改善作用。

既往的研究表明,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在心肌纤维化中有着重要作用,18种HDAC家族成员各自作为压力信号对纤维化进行调控[12-18],同时,已明确基质金属蛋白酶(MMPs) 作为心肌纤维化靶点影响心肌纤维化过程[19,20]。本研究显示,与假手术组比较,心肌梗死模型组小鼠HDAC5、MMP9蛋白水平明显升高,而没食子酸干预组与心肌梗死模型组比较HDAC5、MMP9蛋白水平明显降低。在心肌细胞实验中,与正常对照组比较, HDAC5过表达组MMP9 蛋白及mRNA水平明显升高,而没食子酸干预组MMP9 蛋白及mRNA水平则较HDAC5过表达组显著下降。

综上所述,在心肌梗死心肌纤维化过程中,HDAC5表达水平明显升高,而没食子酸可通过HDAC5信号通路进而下调MMP9进一步抑制心肌纤维化,能够为心肌梗死后心肌纤维化的药物治疗提供一定参考依据。

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