牙周炎患者和牙周健康人群牙龈组织中B细胞、浆细胞及其相关细胞因子表达的差异

欧阳玉玲 陈盛 陈斌

1.上海市静安区牙病防治所牙周病科，上海 200040；2.南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院病理科，南京 210008；3.南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院牙周病科，南京 210008

牙周病是一类由菌斑生物膜引起的慢性感染性疾病，第四次全国口腔健康流行病学调查报告显示，我国人群牙周健康率不足10%[1]。牙周炎是成年人失牙的主要原因，同时，也与全身健康密切相关[2]。而且，牙周炎的病程可长达几十年，因此，其疾病负担不容忽视，遗憾的是，时至今日，牙周炎发病机制仍不十分清楚。

虽然牙周炎由菌斑生物膜引起，然而，菌斑生物膜中细菌的量或者其种类并不能决定牙周炎的进程，大量研究[3-5]表明，宿主对菌斑生物膜的免疫反应决定了疾病的进程。因此，对牙周炎宿主免疫反应的探索，将有助于更好地了解其发病机制，从而利于对疾病的诊治。参与牙周炎的主要免疫细胞包括：中性粒细胞、单核-巨噬细胞系统和淋巴细胞。牙周炎确立期病损以淋巴细胞为主，其中，浆细胞约占总细胞量的50%，B细胞约占20%，且B细胞比例高于T细胞比例[4,6-10]。尽管如此，学者们对T细胞在牙周炎发病机制中的作用和相关机制研究远远多于对B细胞和浆细胞的研究。

近年来，B细胞在免疫相关疾病尤其是自身免疫疾病中的作用被广泛认识，研究主要集中在风湿性关节炎等自身免疫性疾病[11-12]。然而，牙周炎时发生的组织破坏其实也是免疫失衡的结果，与自身免疫密切相关[4-5]。研究[11]显示：对风湿性关节炎患者进行抗B细胞治疗，有助于改善其牙周状况，这提示B细胞可能在牙周炎进展中有重要作用。然而，关于B细胞在牙周炎进展中的作用及其机制目前尚不清楚。为解决这一问题，需要先了解牙周炎时B细胞和浆细胞的表达情况，另外，由于B细胞和浆细胞主要是通过分泌细胞因子和产生抗体发挥功能的，因此，也有必要对相关的关键细胞因子进行分析。

B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）是B细胞活化成为浆细胞的关键细胞因子，而核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）则是由B细胞分泌的、与B细胞发育密切相关且与骨免疫密切相关的细胞因子[13]。动物实验表明：RANKL（+）B细胞的激活可以加速动物的牙槽骨吸收，该作用呈现RANKL依赖性；相反地，阻断RANKL和BAFF则可减少实验性牙周炎时的牙槽骨吸收[5,14]。然而，动物实验的结果并不能完全代表临床情况，为了进一步确认RANKL和BAFF在人牙周炎中的作用，有必要先了解人牙周炎时牙龈组织中BAFF和可溶性RANKL（soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand，sRANKL）的表达水平。因此，本研究拟比较牙周炎患者和牙周健康者牙龈组织中B细胞、浆细胞、BAFF和sRANKL的表达差异，以期为牙周炎的发病机制研究提供更多参考。

1 材料和方法

1.1 病例来源及实验分组

选择2019年5—8月于上海市静安区牙病防治所和南京大学医学院附属口腔医院就诊的18～75岁不伴有全身疾病的牙周炎患者（牙周炎组）和牙周健康者（牙周健康组）为研究对象。牙周炎组纳入标准：1）Ⅲ～Ⅳ期牙周炎患牙（根据2018年牙周分类标准：邻面最严重的位点附着丧失≥5 mm，影像学显示牙槽骨吸收至牙根1/2或根尖1/3）[15]，无法保留者；2）近6个月内未接受过牙周治疗；3）3个月内未使用过抗菌药物。牙周健康组纳入标准：1）牙周组织完整的临床龈健康，其特征为无探诊出血、无红肿、患者无症状、无附着丧失和骨丧失（根据2018年牙周分类标准）[16]；2）因牙冠延长术需切除牙龈组织者。所有患者均无严重系统性疾病及免疫系统疾病。共纳入27例研究对象，其中牙周炎患者（牙周炎组）15例，男8例，女7例，年龄（52.60±14.98）岁，牙周探诊深度（7.60±0.99）mm；牙周健康者（牙周健康组）12例，男4例，女8例，年龄（33.08±10.55）岁，牙周探诊深度（1.67±0.78）mm。

1.2 牙龈组织的采集

牙周炎组：在行牙拔除术时收集多余牙龈组织。牙周健康组：牙冠延长术时收集切除的多余牙龈组织。将收集到的组织分别放入4%中性多聚甲醛（室温）和空置EP管（-80 ℃）备用。

1.3 组织病理学检测

将置于4%多聚甲醛中的组织常温固定24 h，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色并树胶封片。

1.4 免疫组织化学染色检测

常规免疫组织化学染色，染色指标包括CD19、CD38和CD138。CD19所用抗体购自武汉塞维尔生物科技有限公司，CD38和CD138的一抗购自福州迈新生物技术开发有限公司，二抗为山羊抗兔鼠通用二抗（DAKO公司，丹麦）。

使用病理切片全景扫描系统（Pannoramic公司，匈牙利）扫描免疫组织化学染色切片，将普通切片转化为数字切片，并通过Caseviewer软件（Pannora-mic公司，匈牙利）截图，每个患者选取一张切片，每张切片选取3个视野（放大倍数400，视野大小为Caseviewer软件设置为6个图片视图时的图片大小），通过Image J软件进行CD19、CD38和CD138阳性染色细胞数量计算，将3个视野的平均值记为该样本的阳性染色细胞数值。

1.5 酶联免疫吸附测定法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测BAFF和sRANKL的表达

将-80 ℃保存的牙龈组织取出，称量20 mg后匀浆（75 Hz，80 s），离心（4 ℃，12 000 r·min-1）15 min后取上清备用。采用ELISA法检测上清中BAFF和sRANKL的含量，试剂盒均购自武汉欣博盛生物科技有限公司。

1.6 统计分析

采用SPSS 19.0软件对2组数据进行统计分析，统计方法为独立样本t检验。

2 结果

2.1 组织病理学检测

组织病理学检测结果显示：牙周健康组牙龈的上皮钉突较短，结缔组织内少量炎症细胞浸润或无炎症细胞浸润，胶原纤维完整；牙周炎组牙龈上皮钉突明显伸长，可呈网状，结缔组织内大量炎症细胞浸润，胶原纤维断裂（图1）。

图1 2组组织病理学 HEFig 1 Histopathology of two groups HE

2.2 免疫组织化学检测

CD19染色结果显示：CD19（+）细胞（B细胞）主要分布在结缔组织中；牙周炎组的CD19（+）细胞数量高于牙周健康组，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）（图2）。

图2 2组CD19免疫组织化学染色Fig 2 Immunohistochemical staining against CD19 of two groups

CD38染色结果显示：CD38（+）细胞（浆细胞）主要分布在结缔组织中，且成群聚集；牙周炎组CD38（+）细胞数量高于牙周健康组，差异有统计学意义（P＜0.000 1）（图3）。

CD138染色结果显示：浆细胞和上皮细胞都呈CD138阳性表达，但根据上皮细胞特定组织位置及2种细胞结构及形态差异，仍可通过CD138染色来辨识浆细胞；CD138（+）（浆细胞）的分布位置及聚集特点与CD38相似，且牙周炎组浆细胞数量高于牙周健康组，差异有统计学意义（P＜0.000 1）（图4）。

图3 2组CD38免疫组织化学染色Fig 3 Immunohistochemical staining against CD38 of two groups

图4 2组CD138免疫组织化学染色Fig 4 Immunohistochemical staining against CD138 of two groups

2.3 2组BAFF和sRANKL的表达

ELISA检测结果显示：牙周炎组BAFF表达高于牙周健康组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5）；牙周炎组sRANKL表达高于牙周健康组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图6）。

3 讨论

免疫反应贯穿牙周炎发生和发展的全过程。其中，淋巴细胞发挥了关键作用，以往的研究大多是关于T淋巴细胞在牙周炎发病机制中的作用，然而，最近的研究[3-5]表明，B淋巴细胞也可能在牙周炎发生发展中发挥关键作用。

图5 2组BAFF表达Fig 5 BAFF expression of two groups

图6 2组sRANKL表达Fig 6 sRANKL expression of two groups

本研究结果显示：牙周炎时，组织中有大量炎症细胞浸润，其中以淋巴细胞为主（图1），其组织病理学特点符合慢性炎症性疾病的特征。进一步的研究显示：牙周炎时，CD19（+）的细胞数量有所增多（图2），CD19是B淋巴细胞的标志物，提示，牙周炎时B淋巴细胞数量增多。对于浆细胞，本研究采用了CD38和CD138这2个经典标志物来标记，研究结果表明牙周炎患者牙龈组织中浆细胞数量明显高于牙周健康者（图3、4），且浆细胞是牙周炎时牙龈组织中的主要浸润细胞，这与其他学者[3,10,17]的研究结果一致。综上，B细胞和浆细胞的数量变化与牙周炎症状态密切相关，这些细胞可能参与了牙周炎的发生发展。

此外，本研究的结果还显示：牙周炎患者牙龈组织中BAFF的表达也高于牙周健康者（图5）。BAFF是Moore等[18]在1999年发现的新的肿瘤坏死因子超家族成员，其主要功能在于促进B细胞的分化成熟和免疫球蛋白的分泌。目前对于BAFF的研究主要集中于其与自身免疫病的关系上，BAFF在一些免疫系统疾病，尤其是自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎中表达升高，可能是重要的致病因子。而牙周炎的发病机制与这2种疾病有相似之处，牙周炎患者唾液和血清中有着显著高水平的BAFF，与牙周袋深度、附着丧失和探诊出血水平都有着密切相关性，提示BAFF可能与牙周炎症密切相关。然而，以上的研究都是间接证据，本研究以人牙龈组织为研究对象，结果表明牙周炎时，牙龈组织中BAFF的表达升高，为BAFF可能与牙周炎症密切相关提供了更加直接和确切的证据。

本研究结果还显示，牙周炎患者牙龈组织中sRANKL的表达也高于牙周健康者（图6）。RANKL属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成员，RANKL和核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）的结合是破骨细胞形成的必要条件，在骨免疫平衡中有至关重要的作用。RANKL可以由淋巴细胞、间质细胞和其他类型的细胞分泌，牙周炎时，RANKL的主要来源是T淋巴细胞和B淋巴细胞。牙周炎时，B细胞尤其是被激活的B细胞，其RANKL表达升高。B细胞促进牙周炎时牙槽骨破坏依赖于RANKL，而非依赖于其抗体分泌功能[19]。本研究的结果在人类样本中确认了牙周炎时牙龈组织中的sRANKL表达有所升高，提示RANKL与牙周炎可能关系密切。然而，值得注意的是：sRANKL在同一群体的不同个体间的差异非常明显（图6），异质性较大，其原因可能是：1）sRANKL在个体间的差异本来就很大[20]；2）sRANKL可能与牙周炎的活动期和静止期有关。本研究中牙周健康者探诊都不出血，而牙周炎患者探诊都出血（表1），单就探诊出血这一因素而言，如果说探诊出血（+）就意味着牙周炎活动期的话，在所有样本都是来自于探诊出血（+）位点的情况下，sRANKL的数值在组内的差异却非常明显（图6），从而显得sRANKL似乎和牙周炎的活动期无关。然而，临床指标的变化通常迟于组织病理分子学的变化，考虑到探诊出血（+）是目前预测牙周炎活动期的比较常用的指标，然而探诊出血（+）位点事实上并不总意味着未来的牙周组织破坏，且sRANKL与牙周炎时的牙槽骨破坏密切相关，因此，笔者推测，sRANKL有可能是预测牙周炎活动期的敏感指标。另有研究[21]表明，其他和牙周炎发病机制非常类似的骨破坏性疾病（如强直性脊柱炎），其sRANKL水平的升高和骨密度降低具有相关性，这进一步提示sRANKL有可能是预测牙周炎活动期的敏感指标。

综上，牙周炎时，牙龈组织中B细胞和浆细胞的浸润明显增加，且这些细胞的相关细胞因子BAFF和sRANKL的水平也有所增加，提示，B细胞和浆细胞及其细胞因子与牙周炎症密切相关，可能参与了人牙周炎的疾病进程。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。