PMA-LAMP法可视化检测乳中沙门氏菌

王冠蕾

（承德石油高等专科学校，河北承德067000）

0 引言

沙门氏菌（Salmonella）是世界上最常见的食源性致病微生物之一，能够引起人类和许多其他动物疾病，如人肠胃炎、伤寒病、败血症等[1]。隶属于肠杆菌科，能运动，无芽孢，兼性厌氧，革兰氏呈阴性。沙门氏菌菌属类型多样，抗原复杂，基于O抗原和H抗原，目前已分离出2 500多个血清型，且生物体高度多样化，并仍在演变。作为一种最常见的细菌性病原体，可以通过栖息环境、饲养过程以及水源传播，并通过原料乳、肉类或蛋类等动物源性食物的不恰当烹饪或加工过程而传染人类[2-4]。研究报道，婴儿配方奶粉（Powdered infant formula，PIF）是沙门氏菌感染婴儿的主要途径[5]。因此，沙门氏菌的污染及其在PIF中快速检测方法是关注和研究的热点之一。

目前分子生物学检测技术逐渐广泛应用于食源性致病菌的检测中，成为了一种新型的快速鉴定方法并具有一定的优势。其中，环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于其简单、快速、检测线低等特点，应用范围逐渐拓宽，具有较大的发展前景[6-8]。LAMP技术的研发是由日本Notomi博士利用体外扩增核酸的原理[9]，设计4～6条LAMP引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，一定的恒温条件可引发自动循环链置换反应，对DNA进行循环扩增，从而达到快速扩增目标核酸片段的目的，其已经被用于食品中沙门氏菌的检测[10-12]。对于产物的检测，可利用羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue，HNB）染料预先添加到反应体系中进行可视化检测，HNB根据溶液反应前后p H值的不同而产生颜色变化，阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色，从而用肉眼即可对结果进行观察判断。整个过程避免了开盖检测，因此不会产生假阳性结果，也不需要专门的检测设备，经济实用并适合于现场快速检测，与LAMP技术的结合在近年内被广泛关注和应用[13-16]。但由于LAMP方法的高检测灵敏度，能同时扩增样品中的死菌和活菌的DNA，易造成高估样品中活菌的水平和假阳性结果。美国Biotium公司研发的荧光染料—叠氮溴化丙锭（Propidium monoazide，PMA）具有几乎完全细胞膜不渗透性，可以选择性的结合从死细胞中暴露出来的DNA，而远离未受损伤的活细胞中完整的DNA，从而有效地用于死/活菌的区分[17-19]。

本研究建立一种以荧光染料PMA与LAMP快速检测技术相结合的方法，以沙门氏菌siiA基因为特异性靶标，同时结合HNB可视化检测方法，用于快速、准确的检测PIF中沙门氏菌，为食品中致病菌的检测开辟一个新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验所用菌株见表1。使用的主要试剂有：引物，北京诺赛基因组研究中心有限公司；PMA，美国Biotium公司；LB培养基，青岛海博生物有限公司；2×Taq PCR MasterMixTaq，北京天根生物技术有限公司；Bst2.0 DNA Polymerase，New England Biolabs公司；MgSO4，New England Biolabs公司；d NTPs，北京天根生物技术有限公司；羟基萘酚蓝（HNB），美国Sigma-Aldrich公司。

表1 试验用菌株及其来源和LAMP检测结果

1.2 仪器与设备

移液器，Eppondorf公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DYY-10C型电泳仪，上海安亭科学仪器厂；UVP凝胶成像系统，美国UVP公司；电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；ZHWY200B型恒温培养摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；精密电子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.4 HNB染料的优化及可视化检测体系的建立

1.2.4 裸鼠移植瘤模型构建 取对照组、阴性组、干扰组CaSki细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液将细胞消化，1000 g离心10 min，把上清溶液吸弃，添加PBS，将细胞配制成每毫升含有4×107细胞的单细胞悬浮液，吸取300 μL注射至裸鼠右侧后腿皮下，裸鼠均出现移植瘤。分别在接种CaSki细胞后7、12、17、22、27 d测量肿瘤体积，肿瘤体积=（长径×短径2）÷2。在最后1次测量肿瘤体积后，脱臼法将裸鼠处死，取肿瘤组织，称取肿瘤质量。

九条“高压线”迟恒条条碰，说是碰，又像是在上面走钢丝，平衡功夫似乎不错，因为迄今为止，被他捅到的那些部门，只有来求情的，没有来问罪的，至少说明一点，也是很重要的一点，此人稳重。

1.3.2 DNA的提取

在花生的生长过程中，如何更好的发挥出单粒精播的优势，是我国农户和科研人员都在思考的一个问题。本文通过对花生种植过程中种子处理、整地翻地、田间管理等方面进行分析，希望可以为农户以及研究人员提供一些参考。

4.4.2 搭建网络交流平台。利用网络虚拟平台，进行教师实践指导、学生分组讨论和实践成果分享，引领学生在理解与合作的情感状态下开展综合实践活动；拍摄环境生态工程综合实习视频，整合理论教学过程中已有的专题实践教学内容资源(图片、视频、网页等)，进行网络分享；通过网络进行教师与学生、学生与学生之间的实践互动(如经验分享、个案解析、成果展示等)。

1.3.3 引物的设计与LAMP扩增

随着互联网与移动终端的紧密结合，从电子商务到互联网金融，每时每刻都在产生大量的数据。传统的风险分析方式已不能适合金融机构的业务，数据挖掘技术对多维度、大数据的智能、批量处理，更贴合信息化时代的风控要求。金融投资行业越来越多地采用机器学习、数据挖掘的方法进行风险评估。大数据已经成为金融机构加强风险控制的重要手段。然而，实际采集得到的数据中，各种类数据样本的分布并不均匀，使得某些类型的数据被淹没在巨量数据中，影响数据分析结果的准确性。因此如何充分利用采集得到的数据，对于准确有效的风险预测分析，显得尤为重要。

本研究针对沙门氏菌保守序列siiA基因（STM 4257，在NCBI中的序列号为：NC_003197）[20]，利用在线软件PrimerExplorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html），设计4条LAMP引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP。引物序列见表2。

采用25μL LAMP扩增体系进行反应，分别对引物比例、试剂浓度、反应温度和时间进行优化，并利用琼脂糖凝胶电泳（AGE）在紫外灯下观察扩增结果，选择最优条件对提取的DNA进行LAMP扩增。

1.3.1 菌株的培养与保藏

用去离子水将HNB粉末稀释为1.5 mmol/L浓度的母液并进行分装，于-20℃下避光储存备用。之后优化LAMP体系中HNB染料的浓度，调整其母液的添加量使体系中终浓度分别为90、120、150、180、210 μmol/L，并进行LAMP扩增反应，以2μL双蒸水代替DNA作为阴性对照。根据阳性结果显示天蓝色，阴性结果显示紫色的情况选择HNB的最佳浓度。从而建立针对沙门氏菌的LAMP-HNB可视化检测体系。

1.3.5 菌液的PMA处理

在20 mL LB液体培养基中，以2% 的接种量加入冻存菌液，于37℃、200 r/min的条件下培养8 h，并重复一次对菌液进行二次活化。之后经LA固体培养基活化后，挑取单菌落在相同条件下培养8 h，以获得对数生长期末期的菌种，用于后续试验。取上述菌液750μL加入冻存管，再加入250μL 80% 甘油，无菌条件下将液体混匀并密封，置于-20℃冰箱中保藏。

据叶霭玲说，当白丽筠去拉房地产大鳄森达房地产公司李老板的存款时，被李老板招了安，成为身家上亿的李老板的小三，顺便在李老板的公司当了售楼小姐。这里的主次关系是与白丽筠的讲述颠倒的。我不知道究竟该相信哪一个版本，但是所谓兼听则明，两方面都听到，事实真相基本上就清楚了。

PMA溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成1 mg/mL的PMA溶液，-20℃黑暗处保存。取1 mL制备好的菌悬液置于2 mL离心管中，加入PMA溶液至终浓度为3μg/mL，混匀后在室温条件下避光培养5 min，然后放置在距离光源20 cm处，利用650W卤素灯曝光5 min，为了防止温度过高应将样品放在冰上进行交联，交联后的悬浮液于13 000×g离心5 min，得到的沉淀用于后续试验。本研究采用95℃热处理3 min杀死菌体，然后分别取1 mL活菌液和死菌液，经PMA处理后用于DNA提取和LAMP检测，同时分别取1 mL未经PMA处理的活菌液和死菌液作为对照。

表2 LAMP引物及序列

1.3.6 特异性验证

1.3.7 纯培养物灵敏度检测

应用构建好的PMA-LAMP-HNB可视化检测方法，针对14株沙门氏菌和9株非沙门氏菌进行特异性验证，观察琼脂糖凝胶电泳条带的有无和添加HNB的体系颜色变化，判断检测方法的特异性。每个菌株均做三组平行试验。

选取鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028作为标准菌株进行培养，并用0.85% 的生理盐水将菌液进行10倍梯度稀释并涂布计数，确定其活菌浓度，使目标菌浓度范围在107～10-1CFU/mL之间，之后加入固定浓度的死菌，经PMA处理后提取不同浓度菌液的DNA进行LAMP扩增，利用LAMP-AGE和LAMP-HNB法分别对2μL产物进行灵敏度检测。

本研究利用一步法快速提取细菌基因组DNA。取300μL细菌培养液于2 mL EP管中，12 000×g离心2 min，弃去上清液，向沉淀中加入300μL DNA提取液（25% Chelex-100，p H=8.0），混匀后于95℃下水浴10 min，再冰浴3 min，然后12 000×g离心2 min，取上清液（即为DNA）并于-20℃冰箱中储存。

1.3.8 婴儿配方奶粉灵敏度检测

将购买的婴儿配方奶粉按照FDA建议的常规检验法进行检测，以确定奶粉中完全不含有沙门氏菌[21]。然后取10 g奶粉溶于90 mL无菌的蛋白胨水溶液中，均匀混合，分别加入不同稀释度的纯培养菌液，以获得沙门氏菌的终浓度范围在107～10-1CFU/g之间的人工污染PIF样品。经PMA处理后，提取奶样中沙门氏菌的基因组DNA进行LAMP扩增，并利用LAMP-AGE和LAMP-HNB法分别对2μL产物进行灵敏度检测，以确定检出限。同时，与传统PCR方法作比较。

医疗损害纠纷案件中由于专业所限，常需要对患者的损伤程度、诊疗行为与损害结果是否存在因果关系等专门性问题进行鉴定，以使法官更深入地了解案情，便于做出公正的裁判。侵害患者知情同意权责任纠纷案件亦有许多需要进行鉴定之处，但部分判决书对于鉴定部分的阐述过于简单，使人难以清楚了解鉴定的事项。在这些判决书中，对于鉴定意见进行总结书写仅仅一句带过，使阅读者仅能知悉医院是否有过错，承担责任的轻重，难以进一步了解其他信息，比如有判决书的表述为：“结论为该争议属于一级甲等医疗事故，医院承担轻微责任。”[12]未明确说明为何认定医院承担轻微责任以及医院应承担责任的具体比例，仅以“轻微”二字概括，过于简略。

10月22日，中国工会十七大在北京胜利召开。大会主题：以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导，坚持走中国特色社会主义工会发展道路，忠诚党的事业，竭诚服务职工，团结动员亿万职工为决胜全面建成小康社会、夺取新时代中国特色社会主义伟大胜利而奋斗！向全会上下发出号令，提出要求。此时此刻，重温、学习、领会、践行习近平关于工人阶级和工会工作的重要论述，对于把建设有中国特色社会主义工会伟大事业不断推向前进，具有重大的现实意义和深远的历史意义。

2 结果与分析

2.1 LAMP体系的确定

通过对LAMP体系中各组分及反应条件的优化，建立了最佳的LAMP反应条件：采用25μL体系，含有0.2μmol/L外引物F3/B3、1.6μM内引物FIP/BIP、1.8 mmol/L d NTPs、2.5μL 10×ThermoPol Buffer、4 mmol/L MgSO4、0.9μL Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase（8 u/μL）和2μL模板DNA，加入双蒸水至25μL。将体系置于65℃反应45 min，80℃条件下2 min终止反应。

2.2 羟基萘酚蓝染料添加量的确定

LAMP体系的HNB优化结果如图1所示。阴性对照组呈紫色，当HNB的浓度为90μmol/L和120 μmol/L时，阳性反应体系未变色，仍显示紫色，当HNB的浓度不低于150μmol/L时，阳性反应体系呈现天蓝色，因此HNB染料的最佳终浓度为150μmol/L，可实现LAMP-HNB可视化检测沙门氏菌。

2.3 PMA-LAMP-HNB可视化检测方法的建立

图1 HNB浓度的优化

PMA作为一种分子染料，只能穿过已死亡细菌的细胞膜（壁），在光激发后能与DNA共价结合，从而阻断其扩增反应。为了证明PMA-LAMP可视化方法能够选择性只扩增活菌从而进行验证试验，结果如图2所示。泳道2至泳道4均有LAMP扩增条带，而泳道5未出现LAMP扩增结果。说明PMA-LAMP方法能够有效地抑制死菌的扩增，使其只检测活菌，防止假阳性结果的产生。同时LAMP-HNB检测结果与电泳结果一致，说明利用HNB染料进行可视化检测的可行性。因此，PMA-LAMP-HNB可视化检测沙门氏菌的方法成功建立。

图2 PMA-LAMP-HNB方法的建立

2.4 可视化检测方法的特异性验证

针对全部34株菌株，经PMA处理后，LAMP扩增产物的两种检测方法结果如表1所示，对所有14株沙门氏菌的AGE和HNB可视化检测结果均为阳性，而对所有的20株非沙门氏菌的扩增结果均为阴性。因此证明PMA-LAMP-HNB可视化检测方法对沙门氏菌具有特异性。

2.5 纯培养物的检测灵敏度

沙门氏菌纯培养物灵敏度的检测结果如图3所示，通过平板计数以确定沙门氏菌的浓度范围为4.6×107CFU/mL至4.6×10-1CFU/mL。对 于PMA-LAMP扩增产物的检测结果，AGE和HNB染料法的结果表现一致。在对照组显示阴性的情况下，当纯培养物活菌的浓度在4.6×107CFU/mL至4.6×101CFU/mL时，检测结果均为阳性，而在100CFU/mL和10-1CFU/mL浓度时均呈现阴性。因此PMA-LAMP-HNB可视化检测方法对于沙门氏菌活菌的检测灵敏度为4.6×101CFU/mL，与AGE检测灵敏度相同。

图3 沙门氏菌纯培养物的灵敏度

2.6 人工污染乳中沙门氏菌的检测灵敏度

PIF中沙门氏菌灵敏度的检测结果如图4所示，通过平板计数以确定人工污染乳中沙门氏菌活菌的浓度范围为6.3×107CFU/g至6.3×10-1CFU/g。当目标菌浓度在6.3×107CFU/g至6.3×101CFU/g时，电泳结果出现LAMP扩增典型的T型条带，带HNB染料的体系均呈现阳性结果的天蓝色，此时对照组呈现阴性结果，说明LAMP-HNB检测法灵敏度为6.3×101CFU/g，而PCR-AGE法的灵敏度为6.3×103CFU/g。因此，PMA-LAMP-HNB可视化检测方法对于PIF中沙门氏菌活菌的检测灵敏度与AGE检测灵敏度相同，是传统PCR方法的100倍。

图4 婴儿配方奶粉中沙门氏菌的灵敏度

3 结论

本研究基于沙门氏菌siiA基因设计4条LAMP引物，在65℃恒温条件下扩增45 min，通过预先向体系中添加150μmol/L HNB染料，实现对扩增产物的可视化检测。同时利用3μg/mL PMA荧光染料对菌液进行预处理，防止假阳性结果，达到检测活菌的目的，从而建立一种针对婴儿配方奶粉中沙门氏菌的PMA-LAMP-HNB可视化检测方法。总检测时间不超过1 h 30 min，对纯培养物和人工污染PIF中沙门氏菌的检测灵敏度分别为4.6×101CFU/mL和6.3×101CFU/g，与LAMP-AGE检测灵敏度相同，是传统PCR检测方法的100倍。此方法具有强特异性和高灵敏度，不需要使用精密昂贵的试验设备，操作简单，可应用于其他微生物检测、诊断等领域。