促睡眠酸乳的制备及其功能评价

王平，周海燕，曾万钧，李院，何赟，李志成

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌712100；2.西安银桥乳业（集团）有限公司，陕西 临潼710600)

0 引言

快节奏的生活使加班熬夜、生活不规律的人群日益增多。人们长期处于一种较紧张的状态下，就很容易导致失眠的发生[1]。长期失眠会严重影响患者的社交、学习、工作和认知等日间功能，降低患者的生活质量及幸福感。

酸枣仁为鼠李科植物酸枣（Ziziphus jujuba Mil1.var。spinosa (Bunge) Huex H.F.Chou）的干燥成熟种子[2]，具有补肝、宁心、敛汗和生津作用，临床用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症[3]。酸枣仁在镇静、安眠、抗惊厥、降血脂等方面有很好的功效，已广泛应用在药品和保健食品中[4]。酸枣仁始载于《神农本草经》，列为上品，其后在历代文献中均有记载，如《名医别录》中“酸枣仁疗心烦不得眠”。实验表明酸枣仁能抑制中枢神经系统的活动，起到镇静、催眠的作用，能加强并稳定延长巴比妥类药的催眠作用[5]。茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf.）为多孔菌科卧菌属真菌的干燥菌核，味甘淡，性平，有健脾补中、安心养生、利水渗湿的功效，我国食用茯苓已有长达千年的历史[6]。陈春霞研究证实羧甲基茯苓多糖注射液具有催眠作用，能增强硫喷妥钠对小鼠中枢的抑制，使小鼠翻正反射消失持续时间显著增长，而且可以增强麻醉效果[7]。

五味子为木兰科植物五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）的干燥成熟果实。五味子含有丰富的有机酸、维生素、类黄酮、植物固醇及五味子素等木酚素，能益气强肝、增进细胞排除废物的效率，具有镇静、催眠作用[8]。

百合（lilium spp.）为百合科百合属植物。百合干为百合的干燥肉质鳞叶，具有解毒、养阴润肺、理脾健胃、宁心安神等功效[9]。所选材料酸枣仁、茯苓、百合与五味子均是药食两用的材料。

目前，促睡眠产品主要是中药复方口服液[10]，药食两用的促睡眠酸乳未见报道。酸乳因其营养价值高、风味独特受到普遍欢迎。本试验的目的是获得酸枣仁和茯苓、五味子、百合干的提取物，添加到酸乳中制备促睡眠酸乳，然后，通过动物试验评价其促睡眠功能，为促睡眠酸乳的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

保加利亚杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus），西北农林科技大学食品科学与工程学院保存；牛奶（蛋白质3.04±0.16% ，脂肪3.26±0.10% ，糖4.41±0.13% ），购于西北农林科技大学试验农场；酸枣仁、茯苓，五味子，百合干购于医药超市；实验动物为SPF级昆明小鼠，体质量20～25 g。生产许可编号为SCXK (陕) 2014-002，实验许可编号为SYXK (陕) 2004-001。小白鼠和饲料均购自购于第四军医大学实验动物中心，饲料为标准的小鼠全价颗粒饲料。试验期间，室温22℃+2℃，相对湿度为55% ～68% 。

1.2 仪器设备

L5紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；TGL-16G型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；PB-10 p H计，德国Sartorius公司；HH-S4型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；SB-5200DT超声清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；YX-DHS-II隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-1F超净工作台，苏净集团安泰公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 酸枣仁提取物提取方法比较试验

（1）水提法：选择颜色、形态正常的酸枣仁，炒至鼓起，色微变深，碾碎，加入10倍量的纯净水，浸泡30 min，90℃加热提取30 min后用滤布过滤，于滤渣中加10倍量的纯净水重复提取30 min，合并滤液，50℃真空浓缩到相当于原药1 g/mL，即得酸枣仁提取物。

（2）醇提法：将微炒的酸枣仁碾碎，加入8倍量体积分数80% 的食用酒精，回流提取1 h，滤布过滤，于滤渣中再加8倍量的食用酒精回流1 h，过滤，合并滤液，真空浓缩至1 g/mL，即得酸枣仁提取物。

牛乳中分别添加上述两种方法提取的酸枣仁提取物，参照陈文硕等[11]的方法制作酸乳样品，比较酸乳的感官品质，以确定酸枣仁适宜的提取方法。

1.3.2 促睡眠酸乳的制备

（1）茯苓、五味子与百合干提取物的制备。分别选择颜色、形态正常，干爽的茯苓、五味子与百合干，其中茯苓需切碎如大豆粒大小，然后分别加入10倍量的纯净水，室温 (20～25℃) 浸泡30 min，参照酸枣仁水提物的制备方法制备茯苓、五味子与百合干提取物[8-9]。

（2）促睡眠酸乳配方确定。参照陈文硕等[11]的方法，配料时加入酸枣仁和或茯苓、五味子、百合干混合提取物（茯苓、五味子与百合干的质量比为 (1∶1∶1）制备促睡眠酸乳。根据预试验和有关资料[11]在确保功能的前提下设计正交试验表（见表1），获得促睡眠酸乳的配方。

表1 促睡眠酸乳配方的正交试验的因素与水平

1.3.3 感官评定方法

感官评定由有品评经验的老师和同学共10人组成，评价指标包括色泽、滋味和气味及组织状态[12]。

1.3.4 酸度测定

按照GB 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度测定》进行[13]。

1.3.5 促睡眠酸乳功能评价

购买昆明小鼠60只，小鼠自由摄食和饮水，适应性喂养3 d后，剔除个体质量异常者，选取50只随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ共5组，每组10只，雌雄各半，分别标号、称重，试验前小鼠个体质量差异不显著。其中Ⅰ组为生理盐水对照组，灌胃生理盐水；Ⅱ组为普通酸乳对照组，灌胃普通酸乳；Ⅲ组为普通酸乳+茯苓、五味子、百合干混合提取物组，灌胃普通酸乳+茯苓、五味子、百合干混合提取物；Ⅳ、Ⅴ组为普通酸乳+酸枣仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物组，即促睡眠酸乳组，分为低、高两个剂量组。

根据人和小鼠的体表面积比例计算Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组灌胃促睡眠酸乳的量分别为12.5、12.5和25.1 g/kg，分别为人体临床等效剂量的2倍和4倍[14]，普通酸乳组灌胃普通酸乳12.5 g/kg，Ⅱ-Ⅳ组用生理盐水按照成品酸乳：灌胃酸乳=1:1.6稀释，Ⅴ组旋转蒸发仪45℃浓缩为原体积的0.8倍，使Ⅰ-Ⅳ组灌胃剂量均为0.2 mL/10g小鼠体质量。试验开始后对每只小鼠每周称重1次，调整灌胃剂量，连续灌胃14 d。于末次灌胃30 min后每只小鼠按体质量腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠。各组以灌胃后小鼠翻正反射消失为入睡指标，计算入睡时间，以其翻正反射恢复为小鼠的苏醒指标，记录各组小鼠的睡眠时间。

1.4 数据处理

用SPSS22.0分析软件进行数据处理，结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 酸枣仁提取物提取方法比较

由表3可知，添加醇提法酸枣仁提取物所制备的酸乳颜色较深，口感粗糙。而添加水提法酸枣仁提取物生产出的酸乳风味、色泽和口感均比较好，综合考虑，酸枣仁有效成分适宜提取方法为水提法。

2.2 促睡眠酸乳配方确定

以酸枣仁提取物添加量、茯苓-五味子-百合干混合提取物添加量、稳定剂添加量、菌种接种量为因素进行正交试验，以酸度和感官评价为指标，确定促睡眠酸乳的配方，结果见表4。

由表4极差分析可知，各因素对酸乳产酸影响的大小顺序依次为：茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量＞菌种接种量＞酸枣仁提取物添加量＞稳定剂添加量。由处理2、3、5、6、8、9得知，随着茯苓、五味子、百合干混合提取物量的增加，酸度明显下降。由处理1、2、7、8可以看出，随接种量的加大，酸度明显加强。各因素对感官品质影响的大小顺序为：酸枣仁提取物添加量＞接种量＞茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量＞稳定剂添加量，酸枣仁提取物添加量对产品口感影响最大。综合产酸能力和感官评价得出最佳工艺水平组合为A2B1C2D3。根据正交试验结果与分析，可知最佳工艺为：酸枣仁提取物添加量10.0% ，茯苓、五味子、百合干混合提取物添加量7.0% ，接种量4.0% ，稳定剂添加量0.2% 。据此工艺生产的促睡眠酸乳，凝固性好，无乳清析出，酸味柔和，酸甜适口，风味良好。

表4 促睡眠酸乳工艺配方的正交试验结果

2.3 促睡眠酸乳功能评价

2.3.1 促睡眠酸乳对小鼠体质量的影响

表5显示，各组小鼠的初始体质量差异无统计学意义（P＞0.05），即小鼠的初始体质量对试验结果几乎没有影响；试验结束时，各组小鼠的体质量差异不显著（P＞0.05），即试验样品对小鼠组间体质量增长基本无影响。但从表5可以看出，与生理盐水对照组 (I) 相比，普通酸乳对照组 (Ⅱ) 、普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) 和促睡眠酸乳低、高剂量组 (Ⅳ、Ⅴ) 小鼠试验末期的体质量有减轻趋势，虽然差异不显著（P＞0.05），至少说明饮用促睡眠酸乳不会增肥。

2.3.2 促睡眠酸乳对小鼠睡眠质量的影响

由表6可知，生理盐水对照组 (Ⅰ) 小鼠的入睡时间与普通酸乳对照组 (Ⅱ) 和普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) 相比差异不显著（P＞0.05），但与促睡眠酸乳低、高剂量组 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差异极显著（P＜0.01）。促睡眠酸乳低、高剂量组 (Ⅳ、Ⅴ) 小鼠的入睡时间与普通酸乳组 (Ⅱ) 相比差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）。就入睡时间来说，普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) ＜普通酸乳对照组 (Ⅱ) ＜生理盐水对照组 (Ⅰ) ，但差异不显著，说明普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) 和普通酸乳组 (Ⅱ) 均有一定的促进睡眠的作用，普通酸乳与茯苓、五味子、百合干混合提取物有一定的协同作用；普通酸乳与酸枣仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物有良好的协同作用，并呈现出一定的剂量效应关系，低、高剂量组的促睡眠酸乳能显著减少小鼠的入睡时间，因此具有良好的促睡眠作用。

由表6亦可知，生理盐水对照组 (Ⅰ) 小鼠的睡眠时间与普通酸乳对照组 (Ⅱ) 相比差异不显著（P>0.05），但与普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) 和促睡眠酸乳低、高剂量组 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。普通酸乳对照组 (Ⅱ) 的睡眠时间与普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) 相比差异显著（P<0.05），与促睡眠酸乳低、高剂量组 (Ⅳ、Ⅴ) 相比差异极显著（P<0.01）。普通酸乳对照组 (Ⅱ) 小鼠的睡眠时间稍高于生理盐水对照组 (Ⅰ) ，但差异不显著（P>0.05），说明普通酸乳也有一定的促进睡眠的作用。普通酸乳+混合提取物组 (Ⅲ) 能显著延长小鼠的睡眠时间，说明普通酸乳与茯苓、五味子、百合干混合提取物之间有协同作用。促睡眠酸乳低、高剂量组 (Ⅳ、Ⅴ) 能极显著延长小鼠的睡眠时间，说明酸乳与酸枣仁和茯苓、五味子、百合干混合提取物有良好的协同作用，促睡眠酸乳具有显著的促睡眠作用。

表5 促睡眠酸乳对小鼠体质量的影响

表6 促睡眠酸乳对小鼠睡眠质量的影响

失眠可以从形态的变化及延长戊巴比妥类或其他镇静药的睡眠时间上反映出来。失眠主要是由高级中枢神经系统紊乱导致，表现为大脑皮层的抑制转换与兴奋功能失调。1969年，Arpa等[15]提出5-羟色胺（5-HT）失眠学说，得到广泛认可。后来Vgontzas等[16]通过进一步研究发现，失眠可能与下丘脑-垂体-肾上腺轴的昼夜激活有关。蔡定芳等[17]通过研究发现大鼠注射皮质酮后下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴被抑制的同时下丘脑单胺类递质含量升高，与其有关的中枢神经递质如5-HT等可基本反映这一过程。本试验结果与该理论一致，从以下几方面分述。

酸枣仁的化学成分丰富，目前已从酸枣仁中分离得到达玛烷型三萜皂苷、黄酮类化合物、生物碱等活性化学成分[18]。Jiang等[19]对酸枣仁中的皂苷、黄酮和多糖进行了镇静催眠作用的比较，发现黄酮和皂苷均能显著缩短小鼠的运动时间，降低小鼠协调运动能力，并延长巴比妥钠诱导的睡眠时间。Li等[20]研究发现酸枣仁皂苷（主要是酸枣仁皂苷A和B）和酸枣仁黄酮（主要是斯皮诺素）是酸枣仁中发挥镇静催眠的活性物质。祝凌丽[21]也通过研究发现斯皮诺素是通过5-羟色胺系统，并作为5-HT1A受体阻断剂，作用于突触前和突触后5-HT1A受体，从而增强戊巴比妥的催眠作用。

茯苓中含有茯苓多糖成分具有镇静作用[22]。茯苓有效成分的小鼠试验表明，茯苓多糖对小鼠中枢神经可以产生抑制作用，从而延长麻醉时间[23]。张荣标等[24]通过研究复方酸枣仁茯苓口服液对小鼠睡眠的改善作用，发现复方酸枣仁茯苓口服液对小鼠睡眠具有改善作用，其中酸枣仁与茯苓成分具有协同作用，与本研究结果一致。

五味子具有明显的镇静作用。有研究表明，五味子提取物能减少小鼠自主活动，延长巴比妥睡眠时间、抑制动物攻击行为，对抗电休克和化学性惊厥，作用与安定药相似[25]。王春梅[26]等通过研究发现五味子多糖能明显减少小鼠自主活动次数，增加阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的只数，缩短小鼠睡眠潜伏期和显著延长小鼠睡眠时间，表明北五味子多糖具有镇定、催眠及抗焦虑作用。

百合主要活性物质为甾体皂苷类、酚酸甘油脂类和生物碱类等，多用于治疗虚烦惊悸、失眠多梦、精神恍惚[27]。Wang等[28]通过相关性研究发现百合的镇静催眠作用与其总皂苷及薯蓣皂苷具有明显的相关性。李峰杰等[29]通过研究发现百合还能够显著缩短戊巴比妥钠及氯苯丙氨酸致失眠模型动物的睡眠潜伏期，表明百合具有较好的镇静催眠作用。

牛乳中含有较多的色氨酸和微量的吗啡物质[30]，这些物质都有一定的镇静催眠作用[30]，特别是色氨酸，它是大脑合成5-羟色胺的主要原料[32]。5-羟色胺是大脑神经细胞分泌出一种使人欲睡的神经递质，对大脑睡眠起着关键作用，且无任何副作用，因此喝牛奶有利于人们的休息和睡眠[33]。将牛乳加工成酸乳后，由于乳酸菌对蛋白质有降解作用，色氨酸含量明显增加，还会产生促进睡眠的活性肽[34]。Sawada等[35]对参加尸体解剖课程的健康男性研究表明，服用乳酸杆菌4周可显著改善其焦虑、抑郁情绪和整体睡眠质量。而且酸乳营养价值高于消毒牛乳或灭菌生乳，B族维生素可增加10% ～15% 。因此可以说明酸乳比牛奶具有更好的促进睡眠作用。因此，酸乳与酸枣仁及茯苓、五味子、百合干混合提取物之间有协同作用。

3 结论

利用酸枣仁、茯苓、五味子、百合干提取物与牛乳为主要原料，经发酵制得一种凝固性好、无乳清析出、酸味柔和、酸甜适口、风味良好的促睡眠酸乳，其中酸枣仁提取物、茯苓+五味子+百合干混合提取物、稳定剂最佳添加量分别为10.0% 、7.0% 、0.2% ，质量比为1∶1的保加利亚杆菌和嗜热链球菌的最佳接种量为4.0% 。同时就促睡眠酸乳对小鼠睡眠质量影响的研究表明，酸乳与酸枣仁及茯苓、五味子、百合干混合提取物之间有良好的协同作用，并呈现出一定的剂量效应关系。促睡眠酸乳组具有镇静催眠作用，可以满足人们对高效，无毒副作用的新型功能性乳制品的需要,市场前景广阔。