不同处方配比及提取工艺对银柴退热汤解热镇痛抗菌抗炎作用的影响

谭丽媛，翟康欣，遆安航，陈 瑾，张淑蓉

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

贾氏银柴退热汤是首届全国名中医贾六金主任医师的临床经验方，处方为银翘散、小柴胡汤组方加减而来，由金银花、柴胡、连翘、黄芩等14 味中药组成，具有辛凉解表、清热解毒、利咽透邪之功效，治疗小儿急性上呼吸道感染疗效显著［1-2］。全方无贵重药物，用药易得，南北通用，真正做到了价廉效验，具有广泛的应用和开发前景。中医临床用药特点为辨证施治，常因人、因症而调整处方药量，在将经验方开发成新的中药制剂时，确定处方的配比至关重要。现代药理研究表明，挥发油具有抑菌、发汗、理气、止痛、镇静等药理作用，方中金银花、连翘、柴胡、黄芩等7 味药材中均含有挥发油［3-6］。本实验利用大、小鼠的药理学模型，考察不同处方配比及提取工艺对银柴退热汤流浸膏抗菌解热抗炎镇痛作用的影响，为后期银柴退热汤的开发应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 金银花、连翘、柴胡、黄芩等14 味药材购于安国市聚药堂药业有限公司、河北全泰药业有限公司，经山西中医药大学中药鉴定教研室裴香萍副教授鉴定，均为2015 版《中国药典》收载品种，符合2015 版《中国药典》一部相关项下要求。硫酸庆大霉素注射液（批号：H41020366，天方药业有限公司）；氯化钠注射液（批号：D14072305，山东华鲁制药有限公司）；Mueller-Hinton 琼脂（HB6232，青岛高科园海博生物技术有限公司）；牛肉膏、蛋白胨（批号：20131218，北京博兴生物技术有限公司）；阿司匹林肠溶片（批号：20150601，山西同达药业有限公司）；干酵母粉（批号：GB/T20886，安琪酵母股份有限公司）；羧甲基纤维素钠（批号：20161210，重庆力宏精细化工有限公司）；Tween-80 等试剂均为分析纯。金黄色葡萄球菌由山西生物应用职业技术学院微生物实验室提供。

1.1.2 仪器与动物 DHP-9162 电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；CZB1001 电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）；LMQR-32608 立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；DC 超净工作台（济南安畅医疗设备有限公司）；THZ-D 空气恒温振荡器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）等。SD大鼠、昆明（KM）小鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2014-0013。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备 水煎煮法：按照金银花：柴胡配比为1∶1、2∶1、1∶2 称取药材，加入10 倍量水，煎煮2 次，每次30 min，合并滤液，减压浓缩至生药质量浓度为1 g/mL，即得供试品溶液1、2、3，放置备用。

双提法：按照金银花：柴胡配比为1∶1、2∶1、1∶2称取含挥发油药材，加10 倍量水，水蒸气蒸馏法提取挥发油4 h，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与剩余药材加入10 倍量的水，煎煮2 次，每次30 min，合并煎液与上述水溶液，滤过，减压浓缩至适量，加入挥发油，制成生药质量浓度为1 g/mL 的溶液，即得供试品溶液4、5、6，放置备用。

1.2.2 抗菌实验 采用K-B 纸片扩散法，设置阴性对照组（生理盐水）、庆大霉素组、供试品溶液1～6 组，取6 mm 的无菌滤纸片分别滴加生理盐水、40 μg/mL 庆大霉素、1.00 mg/mL 供试品溶液1～6，各25 μL，挥干溶剂制成药敏片。取20 μL 金黄色葡萄球菌最适菌悬液10-2CFU/mL 于无菌平板，迅速涂布均匀，放入制备好的药敏片，置37 ℃培养箱中倒置培养24 h，重复3 次，用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值［3］。

1.2.3 解热实验 取SD 大鼠，适应性饲养1 周，连续测肛温3 d，使大鼠适应此操作。实验当日每隔1 h 测体温1 次，连续3 次，选取体温在36.6 ℃～38.1 ℃且体温变化不超过0.3 ℃的大鼠供制备发热模型用。体温合格的大鼠禁食12 h，背部皮下注射10 %干酵母混悬液5 mL/kg，每隔1 h 测肛温1 次。8 h 后大鼠体温上升达高峰，选取体温上升1 ℃以上的大鼠供实验用。经筛选后取发热大鼠48 只，雌雄各半，随机分为8 组，每组6 只，分别为模型组、阿司匹林组、供试品1～6 组。 模型组灌胃等体积生理盐水、阿司匹林组灌胃等体积阿司匹林（0.1g/kg），给药组分别灌胃供试品溶液1～6（供试品1、4：22.62 g/kg，供试品2、3、5、6：24.34 g/kg，相当于人临床给药量的2 倍）。给药后每隔1 h 测体温1 次，连续6 次，计算体温变化值［7-8］。

1.2.4 抗炎实验 取SD 大鼠64 只，雌雄各半，随机分为8 组，每组8 只，分别为模型组、阿司匹林组、供试品1～6 组。分组后正常饲养，连续灌胃5 d，每天1 次，模型组灌胃等体积生理盐水、阿司匹林组灌胃等体积阿司匹林（0.1 g/kg），给药组分别灌胃供试品溶液1～6（供试品1、4：22.62 g/kg，供试品2、3、5、6：24.34 g/kg，相当于人临床给药量的2 倍）。末次给药后测量记录大鼠右后足体积，随后用10%的鸡蛋清溶液注射于大鼠踝关节处，0.1 mL/只，建立鸡蛋清致大鼠足肿胀炎症模型。分别记录注射后0.5 h、2 h、4 h 时大鼠右后足体积［7-8］。以注射前后大鼠右后足体积差值计算足肿胀度，并计算各组大鼠足肿胀的抑制率。肿胀度抑制率=（模型组肿胀度-给药组肿胀度）/模型组肿胀度×100%。

1.2.5 镇痛实验 取KM 小鼠80 只，雌雄各半，随机分为8 组，每组10 只，分别为模型组、阿司匹林组、供试品1～6 组。分组后正常饲养，连续灌胃7 d，1 次/d，模型组灌胃等体积生理盐水、阳性组灌胃等体积阿司匹林（0.1g/kg），给药组分别灌胃供试品溶液1～6（供试品1、4：33.94 g/kg，供试品2、3、5、6：36.52 g/kg，相当于人临床给药量的2倍）。末次给药后60 min，每只小鼠腹腔注射新鲜配制的0.5%醋酸溶液0.3 mL，观察并记录15 min 内小鼠的扭体次数（以腹部内凹、躯干与后腿伸展、臂部高起为阳性反应），计算各组对扭体反应的抑制率。抑制率=（模型组扭体次数-给药组扭体次数）/模型组扭体次数×100 %。

2 结 果

2.1 抗菌实验

生理盐水无抑制作用，庆大霉素和供试品1～6对金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。抗金黄色葡萄球菌活性为庆大霉素＞供试品6＞供试品5＞供试品2＞供试品4＞供试品3=供试品1＞生理盐水。供试品4～6 抗菌活性整体优于供试品1～3，说明双提法制备的供试品抑菌效果更好；金银花：柴胡3种不同配比中，抗菌强弱无明显差异。结果见表1。

2.2 解热实验

供试品1 组在给药后1 h，供试品4 组在给药后4 h，供试品5 组在给药后1 h、4 h、5 h，供试品6 组在给药后4 h、5 h，体温降低值与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。供试品4～6 解热作用整体优于供试品1～3，说明双提法制备的供试品解热效果更好；金银花：柴胡3 种不同配比中，解热作用无明显差异。结果见表2。

表1 贾氏银柴退热汤不同提取物对金黄色葡萄球菌活性的影响 （±s）

表1 贾氏银柴退热汤不同提取物对金黄色葡萄球菌活性的影响 （±s）

注：与阴性对照组比较，1）P＜0.05

组别 抑菌圈直径（mm）阴性对照组 6.00±0.00庆大霉素组 19.58±0.011）供试品1 组 11.17±0.181）供试品2 组 13.25±0.491）供试品3 组 11.17±0.571）供试品4 组 12.25±0.411）供试品5 组 14.75±0.321）供试品6 组 15.42±0.091）

2.3 抗炎实验

供试品1 组在注射后0.5 h、2 h，供试品2 组在注射后0.5 h、2 h、4 h，供试品6 组在注射后2 h，致炎后肿胀度与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。供试品4～6 组肿胀抑制率整体高于供试品1～3 组，说明双提法制备的供试品抗炎效果更好；金银花：柴胡3 种不同配比中，抗炎作用无明显差异。结果见表3。

2.4 镇痛实验

供试品1 组、4 组小鼠扭体次数与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明金银花∶柴胡3 种不同配比中，配比为1∶1 镇痛作用最强。

表2 贾氏银柴退热汤提取物对干酵母所致大鼠发热反应的影响 （±s）

表2 贾氏银柴退热汤提取物对干酵母所致大鼠发热反应的影响 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05

组别 n 剂量（g/kg） 致热后体温（℃） 给药后体温降低值（℃）1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h模型组 6 - 40.03±0.15 0.30±0.22 0.66±0.24 0.72±0.40 0.82±0.40 1.10±0.42 1.12±0.40阿司匹林组 6 0.10 39.97±0.01 1.20±0.161） 1.55±0.26 2.00±0.50 2.40±0.231） 2.56±0.201） 0.34±0.16供试品1 组 6 22.62 39.64±0.05 1.10±0.201） 1.04±1.33 0.80±0.48 1.03±0.70 1.54±0.39 1.79±1.15供试品2 组 6 24.34 39.86±0.24 0.43±0.51 1.17±0.32 0.11±0.02 0.57±0.30 0.78±0.20 0.51±0.09供试品3 组 6 24.34 40.12±0.05 0.73±0.19 1.35±0.22 0.89±1.50 0.81±0.12 1.27±0.11 0.60±0.42供试品4 组 6 22.62 40.06±0.06 0.24±0.08 1.57±0.23 1.50±1.05 1.62±0.171） 1.35±0.39 1.27±0.58供试品5 组 6 24.34 40.04±0.04 0.96±0.161） 1.15±0.09 1.21±1.30 1.55±0.511） 1.70±0.421） 2.16±1.45供试品6 组 6 24.34 39.96±0.05 0.82±0.57 1.45±0.04 1.66±0.09 1.95±0.231） 2.18±0.181） 1.34±0.09

表3 贾氏银柴退热汤提取物对蛋清致大鼠足肿胀的影响

结果见表4。

表4 贾氏银柴退热汤提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

3 讨 论

临床研究证实，贾氏银柴退热汤对小儿急性上呼吸道感染疗效确切［1-2］，但现阶段缺少药理实验研究证实。本研究发现，贾氏银柴退热汤具有一定的抗菌、解热、抗炎、镇痛作用，为后期贾氏银柴退热汤的开发应用研究提供了理论依据。不同处方配比对解热抗菌抗炎作用影响不大，对镇痛作用有一定影响，金银花：柴胡为1∶1 时，镇痛作用较明显。提取方法对解热镇痛抗菌抗炎作用均有一定影响，双提法提取时药理作用更明显。最终，我们确定处方配比金银花：柴胡为1∶1，提取方法为双提法进行后续实验。