寻常型银屑病患者外周血髓系树突状细胞CD47的表达

钱 青 高春岩 申宇鸿 宋世珅 郭乃洲 高 雯

1北京市和平里医院，北京，100013；2盐城市第一人民医院，盐城，224000

寻常型银屑病的免疫机制是过度增生的角质形成细胞、炎性树突状细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和T细胞之间相互作用，Th17与调节性T细胞(Treg)失衡，导致皮肤慢性红斑、鳞屑样炎症性病变[1]。在Th17/Treg细胞分化过程中，树突状细胞(dendritic cells, DCs)作为一种重要的抗原提呈细胞发挥重要的作用。DCs细胞表面整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP或CD47)与其配体血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP-1)结合可抑制DCs分化成熟，降低炎性细胞因子的分泌，诱导Treg分化，抑制机体的炎症反应[2,3]。但寻常型银屑病患者外周血髓系树突状细胞(myeloid DCs, mDCs)CD47表达水平及其功能缺乏研究，本次研究通过检测银屑病患者外周血mDCs表面CD47表达水平，并通过体外实验，用CD47配体TSP-1结合单核细胞诱导形成的mDCs，分析其调节Treg细胞分化的能力，探讨其在银屑病疾病中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2018年4月至2019年6月于我院皮肤科门诊就诊的寻常型银屑病患者46例，其中男24例，女22例，年龄20～58(36.2±11.4)岁，均为进行期患者。银屑病诊断标准及分类参照《中国银屑病治疗指南(2008版)》[4]。排除标准：2个月内服用免疫抑制剂、维A酸制剂，系统应用糖皮质激素治疗；伴有关节炎、天疱疮、皮肌炎等自身免疫性疾病；感染或其他炎症疾病。健康对照者为本院健康体检人群，均无炎症性和自身免疫性疾病，其中男24例，女22例，年龄22～56(37.1±10.8)岁，两组性别和年龄差异无统计学意义。本次研究经本院伦理委员会批准，受试者知情同意。

1.2 仪器和试剂 Ficoll淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司，RPMI1640细胞培养液和胎牛血清购自Gibco公司。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重组人白细胞介素-4(rhIL-4)均购自Peprotech公司。异硫氰酸荧光素(FITC)-鼠抗人Lin-1单克隆抗体(mAb)购自BD公司、别藻青蛋白(APC)-鼠抗人CD11c mAb和叶绿素蛋白(PerCP)-cy5.5鼠抗人HLA-DR均购自Biolegend公司。CD47采用藻红蛋白(PE)-鼠抗人mAb。美国BD Canto II流式细胞分析仪检测mDCs细胞表面CD47平均荧光强度(MFI)，作为CD47表达水平。CD4+T细胞阴性分选磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司。hTSP-1购自Abcam公司。anti-CD3购自BD Biosciences公司。APC-鼠抗人CD25、FITC-鼠抗人CD4和PE-鼠抗人FoxP3均购自BD公司。白细胞介素(IL)-23、IL-17和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor, TNF-α)检测试剂购自Bio-rad公司。CD47过表达质粒由上海汉恒生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 患者抽血前评估银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)，得分为5.8～20.2(14.2±4.8)。银屑病患者和健康志愿者在空腹条件下采集肘部静脉血20 mL，肝素钠抗凝，其中0.5 mL用于流式细胞检测mDCs CD47表达，其余用于分离单核细胞，诱导成mDCs。

1.3.2 流式细胞术检测mDCs细胞CD47表达水平 取100 μL肝素抗凝静脉血，加入10 μL FITC-鼠抗人Lin-1mAb、10 μL APC-鼠抗人CD11c mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人HLA-DR mAb和10 μL PE-鼠抗人CD47 mAb，室温避光孵育30 min，然后用红细胞裂解液去除红细胞，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)洗涤，并用400 μL PBS缓冲液重悬，mDCs定义为HLA-DR+Lin-1-CD11c+细胞。流式分析仪检测以HLA-DR+Lin-细胞设门，检测HLA-DR+Lin-CD11c+细胞表面CD47 平均荧光强度。

1.3.3 单核细胞诱导mDCs 取受试者肝素钠抗凝血19 mL，经Ficoll密度梯度离心分离制备单个核细胞，贴壁法分离单核细胞，细胞浓度用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整为5×106/L，置6孔培养板，37℃和5%CO2培养箱中培养，加入500 U/mL rhGM-CSF和10 ng/mL rhIL-4，诱导单核细胞分化，隔二日半量换液，6天后收集悬浮的细胞，即诱导的mDCs。分两份，其中一份经pYr-ads-4-hCD47质粒转染，上调CD47表达。

1.3.4 重组质粒上调银屑病患者mDCs CD47表达 用RPMI 1640培养液将3 μL Lipofectamine 2000脂质体和2 μg pYr-ads-4-hCD47质粒分别稀释至200 μL，然后将两者混匀，混合物在室温条件下孵育20 min，形成质粒转染应用液。上述诱导的mDC，用RPMI 1640培养液将浓度调到4×105/mL，体积为200 μL，然后加入质粒转染应用液200 μL，置于37℃和5%CO2培养箱中孵育5 h，更换为含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液。转染效果用流式细胞仪检测细胞CD47表达水平。

1.3.5 CD4+T细胞制备 留取健康孕妇足月分娩的脐带血，通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞，然后使用CD4+分选磁珠分离CD4+T细胞。采用流式细胞术进行检测分离提纯的细胞，CD4+细胞纯度大于95%。

1.3.6 mDCs与CD4+T细胞共培养 取上述诱导的健康对照者mDCs、银屑病患者mDCs和过表达CD47的银屑病患者mDCs，与CD4+T细胞在24孔板以1∶10比例共培养，反应体系中加入5 μg/mL TSP-1和1 μg/mL anti-CD3，在37℃和5%CO2培养箱中培养5 d后，收集细胞，流式细胞术检测CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞比例；收集上清液，检测细胞因子IL-23、TNF-α浓度。

1.3.7 CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞检测 收集100 μL共培养细胞，加入10 μL APC-鼠抗人CD25和10 μL FITC-鼠抗人CD4，避光孵育20 min。反应体系中加入250 μL Fix/Perm缓冲液，孵育40min，经300 μL Perm/wash缓冲液洗涤，并用100 μL Perm/wash重悬细胞。加10 μL PE-鼠抗人FoxP3，避光孵育30min。PBS洗涤后重悬细胞，流式细胞仪以CD4+CD25+细胞设门，检测CD4+CD25+FoxP3+细胞占CD4+细胞比例。

1.3.8 Luminex检测细胞因子浓度 收集共培养上清液，按试剂说明书检测IL-23和TNF-α浓度，每个标本检测两次，取均值。

1.4 统计学方法 全部数据经Stata 7.0统计软件处理，计量资料均为正态性分布，均数±标准差表示，经students’ t-test作双侧检验，相关性分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测外周血mDCs表面CD47表达水平 流式细胞术检测外周血mDCs表面CD47表达水平(图1)，与健康对照组相比，银屑病患者外周血mDCs细胞CD47表达水平显著降低(32.8±10.3 vs 63.6±12.5)，差异有统计学意义(t=13.2,P<0.001)。见图2。

2.2 银屑病患者外周血mDCs CD47表达水平与PASI相关性分析 银屑病患者外周血mDCs细胞CD47表达水平与PASI负相关(r=-0.651,P<0.05)。见图3。

2.3 诱导的mDCs与淋巴细胞共培养上清液细胞因子检测 与健康对照组相比，银屑病患者组单核细胞诱导的mDCs细胞与淋巴细胞共培养上清液中IL-23、TNF-α浓度显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

2.4 诱导的mDCs与CD4+细胞共培养诱导Treg分化 流式细胞术检测CD4+CD25+FoxP3+细胞占CD4+细胞比例(图5)，与健康对照组相比(n=46)，银屑病患者单核细胞诱导的mDCs细胞(n=46)和CD4+淋巴细胞共培养，诱导的Treg细胞比例显著降低(3.8±1.4% vs 6.2±2.1%)，差异有统计学意义(t=6.5,P<0.001)。

1a：HLA-DR+Lin-细胞；1b：HLA-DR+Lin-CD11c+细胞；1c：mDCs CD47 MFI图1 流式细胞术检测外周血mDCs表面CD47表达水平

图2 外周血mDCs表面CD47 MFI比较 图3 银屑病患者mDCs CD47 MFI与PASI相关性分析 图4 共培养上清液细胞因子浓度 (pg/mL)

注：*P<0.05 银屑病未转染CD47组vs银屑病转染CD47组

2.5 重组质粒过表达CD47的mDCs细胞与CD4+细胞共培养 转染人CD47重组质粒上调银屑病患者mDCs细胞CD47表达。与银屑病未转染组相比，银屑病转染CD47组mDCs细胞与CD4+细胞共培养上清液中IL-23和IL-17浓度显著降低，诱导CD4+Treg分化显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3 讨论

在银屑病的疾病过程中，DCs异常活化是银屑病发病机制中的上游环节[5]，在银屑病患者的皮损真皮层中，浸润的炎性CD11c+髓系DC数量与正常皮肤相比显著增加，并异常活化，分泌大量诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α和IL-23等炎性细胞因子，进一步激活T淋巴细胞，诱导Th1、Th17细胞扩增，是银屑病发病的重要因素[6]。mDCs细胞由单核细胞分化而来，在疾病状态角质形成细胞通过分泌趋化因子CCL20募集大量CCR6+的mDCs到病损部位，维持炎症反应[7]。在小鼠银屑病模型中，通过使用中和抗体去除mDCs的前体即单核细胞，小鼠疾病严重程度显著降低，表明mDCs在维持银屑病症状发挥重要作用[8]。

CD47分子是一种分布于细胞表面的信号受体，与TSP-1结合可抑制DCs细胞成熟和分泌炎症细胞因子，降低机体免疫系统对损伤的应答[9]。动物模型证实，CD47缺陷小鼠经免疫致敏物质刺激后，诱导的炎症反应持续时间显著长于野生型小鼠，机制是DCs细胞CD47信号转导通路抑制T细胞的激活，从而降低炎症反应[10]。本次研究表明，银屑病患者外周血mDCs表面CD47表达显著降低，且和疾病严重程度负相关。Rodríguez-Jiménez等[11]证实银屑病患者外周血CD4+细胞CD47 mRNA和mDC CD47表达降低，单核细胞体外诱导形成的mDCs细胞TSP-1 mRNA表达降低。上述研究均表明，银屑病患者mDCs细胞CD47信号通路表达降低。

银屑病mDCs主要通过产生细胞因子TNF-α和IL-23参与银屑病炎症。与健康人群相比，银屑病患者的病变皮肤和血清中均检测到TNF-α水平升高。TNF-α是IL-23/IL-17信号途径的上游细胞因子[1]，可与IL-17等细胞因子协同作用而增强促炎活性，使用TNF-α阻断剂可改善银屑病患者临床症状，并减少病损组织的IL-17浓度[12]。此外，阻断IL-23也可产生非常有效的临床结果，证明IL-23是银屑病的关键细胞因子[13]。本次研究证实，银屑病患者单核细胞诱导的mDCs分泌高浓度的IL-23和TNF-α。

mDCs产生的IL-23联合IL-1β可诱导CD4+幼稚细胞向Th17分化，向Treg细胞分化降低[14]。Treg细胞是机体抑制炎症反应、维持自身免疫耐受的重要免疫细胞。临床研究证实，银屑病患者血液中IL-23浓度增加，诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化，抑制Treg细胞分化[15]，导致银屑病患者外周血和皮肤中Treg细胞均降低[16,17]。本次研究表明，银屑病患者单核细胞诱导的mDCs与淋巴细胞共培养，诱导Treg细胞比例显著低于健康对照组。重组质粒过表达银屑病患者mDCs细胞CD47，诱导的Treg细胞显著升高，分泌IL-23和IL-17显著降低。上述研究表明，银屑病患者mDCs CD47表达降低与其分泌促炎细胞因子升高有关，通过上调CD47表达可抑制此病理过程。

综上所述，本次研究表明银屑病患者外周血mDCs细胞CD47表达显著降低，并与PASI负相关。通过体外实验证实，银屑病患者外周血单核细胞诱导的mDCs分泌高浓度的炎性细胞因子IL-23和TNF-α，诱导CD4+Treg分化的功能显著降低，通过重组质粒上调mDCs细胞CD47表达可阻断此作用。因此，mDCs细胞CD47低表达可能在银屑病患者疾病过程中发挥重要作用，调控mDCs细胞CD47信号通路可能是寻常型银屑病治疗的新途径。