酱香型白酒第四、五轮次基酒中游离氨基酸分析

吴钱弟，周榆林，王久明，郭 鹏，王 鼎，罗爱民*

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065；2.四川宜府春酒厂有限责任公司，四川成都 611500）

酱香型白酒具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、空杯留香持久的突出特点[1]，深受国人乃至世界人民的喜爱。酱香型白酒具有独特的酿造工艺：高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒，生产周期长、贮存时间长，用曲量大，多轮次取酒[2-3]，赋予了其独一无二的风味。

酱香型白酒多轮次酿造过程中，加曲、堆积发酵和窖池发酵是酱香型白酒酿造独特的关键工艺[4]。大曲为酿造过程带来多种微生物和酶类，使其分解原料中的糖类和蛋白质供微生物利用及生成风味物质的前体物质[5]。堆积发酵是窖池发酵的前提条件，属于边糖化边发酵的过程，通过堆积发酵生成酱香或酱香前体物质[6-7]。堆积发酵结束后，酒醅进行窖池内发酵，在微生物的作用下，继续利用各类原料和前体物质进一步生成各类香气成分[8-9]。

在微生物发酵生成风味物质的过程中，游离氨基酸作为微生物生长代谢赖以生存的氮源来源之一，在某种程度上决定了微生物的生长情况和代谢物的产生[10-11]。更重要的是，游离氨基酸作为多种香气成分的前体物质，在高温堆积和高温馏酒过程中可与碳水化合物发生美拉德反应，是形成酱香风味的重要原因[12-14]。另外，游离氨基酸还是酸、酯等香气成分的重要前体物质，不同的氨基酸能呈现甜、鲜、苦等味道，对白酒的风味及口感形成起着重要作用[10，15]。国内外学者对于蒸馏酒中的氨基酸已有较多研究[16-18]，AQUINO F W等[17]研究了巴西甘蔗酒、朗姆酒和威士忌中20种氨基酸发现脯氨酸含量最高，氨基酸与其风味和质量参数存在一定关系。张庄英等[18]对酱香型、浓香型、清香型、凤香型、兼香型、豉香型和老白干香型的原酒和成品酒氨基酸种类和含量进行研究，发现原酒中酱香型和浓香型氨基酸种类最多，成品酒中酱香型白酒氨基酸种类最多。然而，游离氨基酸作为酱香型白酒中重要的香味组成和多种香气成分的重要前体物质，在酿酒过程中却研究较少。在总共七个轮次的酱香型白酒生产中，第四、五轮次的基酒风味最为突出，香气成分更为丰富[19]，其中丰富的前体物质游离氨基酸发挥着不可替代的作用。本研究通过全自动氨基酸分析仪对酱香白酒酿造中第四、五轮次加曲酒醅、入池酒醅和出池酒醅中游离氨基酸分析，旨在为研究基酒中的香气成分提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基酸标准化合物（牛磺酸，磷-乙醇胺，天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，α-氨基肥酸，甘氨酸，丙氨酸，瓜氨酸，α-氨基正丁酸，缬氨酸，胱氨酸，胱硫醚，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，正亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，高胱氨酸，β-氨基异丁酸，γ-氨基正丁酸，组氨酸，1-甲基组氨酸，色氨酸，肌肽，鹅肌肽，羟基赖氨酸，鸟氨酸，赖氨酸，氯化铵，乙醇胺，精氨酸，羟基脯氨酸，脯氨酸）（均为色谱纯）、锂盐体系（见表1）：德国曼默博尔公司；磺基水杨酸、茚三酮（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。

表1 锂盐体系的配制Table 1 Preparation of lithium salt system

1.2 仪器与设备

A300全自动氨基酸分析仪：德国membraPure公司；5810R台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；WT10002K电子天平：上海梅特勒-托利多有限公司；YM-1000CT超声仪：上海豫明仪器有限公司；PHSJ-4F型pH计：上海仪电科学仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 酱香型白酒酿造及取样方法

取样方法：四川某酱香型白酒酿造车间，以某正常生产的窖池为取样目标，在酿造第四、五轮次的加曲酒醅，入池酒醅和出池酒醅中取样。每次先在3个阶段酒醅的上、中、下分别取30 g左右，然后将3份样品混匀，待测。

1.3.2 制备样品

称取酒醅25 g，加入体积分数57%vol乙醇50 mL，在25 ℃条件下超声处理20 min（100 W，20 kHz），于8 000 r/min离心10 min。取上清液400μL于带过滤膜的小离心管中，加入100 μL 10%磺基水杨酸，混合均匀，置冰箱中2～8 ℃冷藏静置60 min，然后置离心机中以12 000 r/min离心15 min，取上层清液后再次以12 000 r/min离心5 min，上清液用样品稀释液按1∶10稀释，经0.22 μm滤膜过滤后上机分析。

1.3.3 分析条件

分析柱：锂盐分析色谱柱；泵1：A、B、C、D、E、F六个锂盐流动相（具体见表1），每个流动相的分配时间约为A 20 min，B 15 min，C 35 min，D 10 min，E 50 min，F 20 min，150 min程序，流速180 μL/min，0～12 MPa；泵2：茚三酮溶液流动相，流速180 μL/min，0～12 MPa；测量环境：温度15～25 ℃，相对湿度40%～55%。

1.3.4 数据处理

每个试验均处理3个重复，运用AminoPeak2.44外标法定量计算各氨基酸的含量，运用SPSS19.0进行数据统计分析，SIMCA-P15.0对样品和游离氨基酸进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 氨基酸标准品及样品检测谱图

混合氨基酸及其相关化合物标准谱图见图1。由图1可知，通道A（570 nm）共检测到35种氨基酸和化合物，通道B（440 nm）检测到羟基脯氨酸和脯氨酸两种氨基酸。各种氨基酸的分离效果良好，运用AminoPeak2.44处理谱图，以峰面积定量，根据标准氨基酸的校正因子和样品稀释因子计算样品中氨基酸的含量。

第四轮次和第五轮次游离氨基酸检测谱图分别见图2和图3。由图2可知，第四轮次的加曲酒醅（图2A）、入池酒醅（图2B）和出池酒醅（图2C）检测到的游离氨基酸谱图与标准谱图比较，分离效果良好，且在三个阶段检测到的氨基酸种类差别不大。由图3可知，第五轮次的游离氨基酸谱图分离效果良好，且加曲酒醅（图3A）、入池酒醅（图3B）和出池酒醅（图3C）三个阶段检测到的氨基酸种类几乎相同。

图1 氨基酸混合标准品色图谱Fig.1 Chromatogram of mixed amino acids standards

图2 第四轮基酒加曲（A）、入池（B）及出池（C）酒醅游离氨基酸色谱图Fig.2 Chromatogram of free amino acids for fermented grains of adding Daqu (A),loading pits (B) and unpoading pits (C)in the fourth rounds base liquor

图3 第五轮基酒加曲（A）、入池（B）及出池（C）酒醅游离氨基酸色谱图Fig.3 Chromatogram of free amino acids for fermented grains of adding Daqu (A),loading pits (B) and unloading pits (C)in the fifth rounds base liquor

2.2 两轮次总游离氨基酸比较分析

第四、五轮次酒醅在不同阶段游离氨基酸总量见图4。由图4可知，加曲、入池和出池三个阶段酒醅的总游离氨基酸含量呈增加趋势，出池酒醅中的游离氨基酸总量最高，几乎是加曲酒醅游离氨基酸总量的两倍，说明酱香型白酒在堆积发酵和窖池发酵两个阶段产生大量的游离氨基酸，为高温馏酒阶段生成香气成分保证了大量的物质基础。经过上一轮次的高温馏酒，大量的游离氨基酸已转化为酒体中的香味物质，因此加曲酒醅中游离氨基酸含量最低[20]。纵向来看，第五轮次的加曲酒醅和出池酒醅游离氨基酸均明显高于第四轮次同阶段的游离氨基酸总量，第四、五两轮次的基酒风味成分丰富[21]，因此在这两个轮次中游离氨基酸总量是增加的，这或许有助于基酒风味物质的形成。

图4 第四、五轮次基酒各阶段酒醅总游离氨基酸含量Fig.4 Total contents of free amino acids at each stage of fermented grains in the fourth and fifth rounds base liquor

根据各酒醅游离氨基酸总量的差异，对两个轮次各酒醅进行差异性分析，结果见图5。由图5可知，两个轮次各阶段的酒醅差异均较大。第四轮次三个阶段的酒醅彼此之间的差异较小。在第五轮次中，加曲酒醅和入池酒醅的差异较小，但是与出池酒醅的差异较大。值得注意的是，第四轮次的出池酒醅和第五轮次的加曲酒醅差异却很小。因此，堆积发酵和窖池发酵过程产生更多的游离氨基酸，而大曲粉带来的游离氨基酸更少。

图5 第四、五轮次基酒醅游离氨基酸总量差异性分析Fig.5 Difference analysis of total free amino acids of fermented grains in the fourth and fifth rounds base liquor

2.3 不同阶段各游离氨基酸含量分析

第四、五轮次酒醅中各游离氨基酸含量分别见表2和表3。由表2和表3可知，在两个轮次中，各酒醅中检测到的氨基酸类别几乎相同，第四轮次酒醅和第五轮次酒醅分别检测到23种和21种氨基酸或化合物，其中天冬酰胺（Asn）和瓜氨酸（Cit）只在第四轮次的加曲酒醅中检测到。在所有被检测到的游离氨基酸中，中性氨基酸（苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro））的种类最多，酸性氨基酸（天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu））和碱性氨基酸（组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg））种类较少。大多数游离氨基酸在加曲酒醅中的含量最低，从加曲酒醅到出池酒醅的发酵过程中，其含量逐渐增加，出池酒醅中的氨基酸含量最高，因此堆积发酵和窖池发酵产生了大部分的游离氨基酸，为酱香型白酒在高温馏酒过程的风味物质形成提供了酱香或酱香物质前体[22]。其中，丙氨酸（0.424 mg/g和0.86 mg/g），亮氨酸（0.408 mg/g和0.872 mg/g），谷氨酸（0.392 mg/g和0.716 mg/g）和组氨酸（0.372 mg/g和0.896 mg/g），在酿造的第四、五轮次中均有较高的含量，可能与某些风味物质的形成密切相关，如谷氨酸可在谷氨酸脱氢酶的作用下生成氨，与2,3-丁二醇生成香味物质四甲基吡嗪[23]。

表2 第四轮次基酒各阶段酒醅游离氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in fermented grains at each stage of the fourth rounds base liquor

表3 第五轮次基酒各阶段酒醅游离氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acids in fermented grains at each stage of the fifth rounds base liquor

续表

2.4 不同阶段各游离氨基酸差异性分析

运用SIMCA-P 15.0分别对第四、五轮次酒醅所有游离氨基酸进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图6和图7。

图6 第四轮次基酒游离氨基酸主成分分析Fig.6 Principal component analysis of free amino acids in the fourth rounds base liquor

由图6可知，主成分PC1和PC2分别解释了85.5%和14.5%的差异。大多数氨基酸聚集在一起，可归为一类，说明各氨基酸之间存在一定的相关性，彼此间联系紧密。但是，铵离子（NH4+）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、缬氨酸（Val）、磷-乙醇胺（phosphoethanolamine，PEA）和丙氨酸（Ala）六种氨基酸或化合物与其他氨基酸距离较远，因此与其他氨基酸之间的差异较大，同时他们彼此之间也存在一定的差异性。

图7 第五轮次基酒游离氨基酸主成分分析Fig.7 Principal component analysis of free amino acids in the fifth rounds base liquor

由图7可知，主成分PC1和PC2分别占96.3%和3.7%。第五轮次三个阶段酒醅中各氨基酸间的差异与第四轮次相比较小，各氨基酸之间联系更加紧密，彼此之间具有强相关性。另外，与其他氨基酸差异性较大的是铵离子（NH4+）、鸟氨酸（Orn）、牛磺酸（Tau）和磷-乙醇胺（PEA）四种化合物。值得注意的是，铵离子（NH4+）和磷-乙醇胺（PEA）两种化合物在第四轮次中与其他氨基酸差异也较大，这可能与第四、五轮次基酒中风味物质的形成有关。

3 结论

本研究通过茚三酮衍生法对酱香型白酒酿造过程第四、五轮次的加曲酒醅、入池酒醅和出池酒醅的游离氨基酸组成分析，在第四、五轮次分别检测到23种和21种游离氨基酸或化合物，分别是苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、牛磺酸（Tau）、磷-乙醇胺（PEA）、天冬酰胺（Asn）、瓜氨酸（Cit）、1-甲基组氨酸（1Mehis）、鸟氨酸（Orn）和铵离子（NH4+），其中天冬酰胺（Asn）和瓜氨酸（Cit）仅在第四轮次的加曲酒醅中检测到。

大多数游离氨基酸的含量从加曲到入池发酵过程中是逐步增加的，游离氨基酸主要在堆积发酵和窖池发酵过程产生。大多数氨基酸间均存在较强的相关性，只有铵离子（NH4+）和磷-乙醇胺（PEA）两种化合物在两个轮次中均与其他氨基酸表现出较差的相关性。第五轮次各阶段酒醅中游离氨基酸含量高于第四轮次同阶段酒醅的游离氨基酸含量，且第五轮次与第四轮次相比，各游离氨基酸彼此间的相关性更强。游离氨基酸在酱香型白酒风味物质的生成中发挥着不可替代的作用，通过研究基酒香气成分丰富的两个轮次在酿造过程游离氨基酸的产生情况，为研究酱香型白酒中风味物质的生成提供了理论基础。