松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

陈 昊, 罗巧玉, 马秋雨, 初 旭, 袁 超, 刘 颖, 余 伟,吴松青, 王 荣, 梁光红, 张飞萍, 胡 霞,*

(1. 福建农林大学林学院, 福州 350002; 2. 福建农林大学, 生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室, 福州 350002)

松墨天牛Monochamusalternatus，隶属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)墨天牛属Monochamus，幼虫蛀食衰弱木的树干和大枝条，加剧树势衰弱，严重时甚至造成树木死亡；成虫通过取食健康松树枝条补充营养，携带并传播松材线虫病(王玲萍, 2004; Wuetal., 2013)。松材线虫病是由松材线虫Bursaphelenchusxylophilus感染引起的严重林业病害，被称为“松树的癌症”(宁眺, 2004; 张锴等, 2010)，在我国的分布范围已扩大至17个省市，造成巨大的林业经济损失，严重破坏了自然景观和生态环境(潘宏阳等, 2009)。

漆酶(Laccase, EC 1.10.3.2)是蓝色多酚氧化酶家族中的最大组成部分，底物范围广泛，可催化多种芳香化合物的氧化(Baldrian, 2006; 于孟兰和倪金凤, 2014)。漆酶也是两大木质素酶系中的重要一类，在没有过氧化氢的情况下，漆酶可以通过溶解氧直接氧化底物(池玉杰和伊洪伟, 2007)。漆酶在自然界广泛存在，真菌、细菌、高等植物和昆虫中均已找到漆酶(Hulloetal., 2001; Gavnholt and Larsen, 2002; Piscitellietal., 2011; Virketal., 2012)。物种不同，漆酶功能也各有不同。植物漆酶主要参与木质素的合成与降解(Gavnholt and Larsen, 2002)，细菌漆酶则具有黑色素生成、尿酸氧化、抗紫外线辐射等多种功能(Tamakietal., 2010; Yeetal., 2010)。真菌漆酶与色素生成和木质素降解等功能密切相关(Januszetal., 2013; Wang SNetal., 2018)，同时真菌漆酶还可以帮助真菌病原菌克服寄主植物抗性，使病菌免受丹宁酸等植物防卫素的影响，从而增强其侵染能力(Kimetal., 1995)。

在昆虫漆酶的研究中，根据其分布、表达能力和功能的不同主要分为漆酶1(Lac1)和漆酶2(Lac2)。昆虫Lac2广泛存在于昆虫的角质层，并在蛹期和羽化阶段高水平表达(Hattorietal., 2010)。Arakane等(2005)对赤拟谷盗Triboliumcastaneum漆酶2基因(TcLac2)进行了RNA干扰实验(RNAi)，结果赤拟谷盗无法完成表皮硬化和色素沉着，羽化过程受到严重干扰。松墨天牛MaLac2的RNAi实验取得与赤拟谷盗TcLac2相似的结果，表明MaLac2在松墨天牛表皮硬化、色素沉着中发挥了关键作用(Niuetal., 2008)。昆虫Lac1则主要分布在昆虫的肠道、马氏管、唾液腺和脂肪体等部位(Amenyaetal., 2010; Futahashietal., 2010)；在赤拟谷盗、烟草天蛾Manducasexta、冈比亚按蚊Anophelesgamibiae、黑尾叶蝉Nephotettixcincticeps和小菜蛾Plutellaxylostella等昆虫中均发现了昆虫Lac1基因，并认为其可能在食物消化、食物脱毒、离子代谢、自身免疫等方面发挥了重要作用(Dittmeretal., 2004; Arakaneetal., 2005; Gormanetal., 2008; Hattorietal., 2010; Wang ZHetal., 2018)。目前对松墨天牛Lac1的研究尚无报道，其结构、性质和功能是否与其他昆虫漆酶一致均有待研究。

本研究基于课题组前期获得的松墨天牛转录组数据(Wuetal., 2016)，克隆获得了松墨天牛MaLac1基因全长序列，并对其进行了生物信息学分析，继而利用原核表达载体合成MaLac1蛋白，并通过qPCR检测了MaLac1基因在松墨天牛不同生长发育阶段肠道中的表达情况，该结果将为揭示松墨天牛MaLac1基因功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

马尾松虫害木采集于福建省连江琯头镇(26.150°N, 119.593°E)，将虫害木锯成长约1 m的木段，置于长×宽×高=1.5 m×1.5 m×1.0 m的养虫笼内。低龄幼虫采自虫害木树皮，此阶段幼虫蛀食韧皮部；老熟幼虫和蛹直接采自受害马尾松木段内松墨天牛幼虫坑道及蛹室，此阶段幼虫蛀食木质部；成虫则取自养虫笼内羽化10 d的成虫，用新鲜松枝喂养，饲养温度26～28℃，相对湿度70%～80%。

1.2 样品总RNA的提取及cDNA的合成

取1.1节中松墨天牛低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫各10头，在显微镜下切开头部和尾部，再用昆虫针挑出肠道，按照Trizol试剂说明书进行总RNA提取，RNA置于-80℃保存。以1 μg总RNA为模板，按照BestarTMqPCR RT Kit说明书配制逆转录反应体系，总体系为10 μL，合成cDNA第1链，在-20℃条件下保存，用于后续的定量表达分析。另取松墨天牛老熟幼虫新鲜肠道组织，按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA第1链，用于基因中间片段扩增。

1.3 松墨天牛MaLac1基因中间片段的扩增

参照转录组序列信息(Wuetal., 2016)，根据注释信息筛选出松墨天牛漆酶基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成引物(表1)，以1.2节中合成的松墨天牛老熟幼虫新鲜肠道组织cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系(50 μL): ddH2O 15 μL, 2×Ex Taq Buffer(TaKaRa) 25 μL, dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL, Ex Taq(TaKaRa) 1 μL, cDNA第1链5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL。反应程序: 95℃预变性2 min; 94℃变性20 s, 58℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环。参照DNA纯化试剂盒(OMEGA)说明书，将产物切胶回收并纯化。将纯化产物连接至pMD18T载体，经转化后筛选阳性克隆，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并通过MEGA 6.0序列比对分析进行转录组序列验证。

1.4 松墨天牛MaLac1基因的全长RACE

根据1.3节中松墨天牛MaLac1基因的中间片段序列，采用Primer Premier 5.0软件设计3条特异性5′RACE引物GSP-1, GSP-2和GSP-3和2条特异性3′RACE引物3′978-1和3′978-2分别克隆MaLac1基因的5′端序列和3′端序列(表1)。基因的5′RACE使用Superscript II RT 酶和引物GSP-1对总RNA合成目的基因cDNA第1链，再用RNase进行处理。采用DNA Purification System: GLASSMAX DNA Isolation Spin Cartridges完成对cDNA的纯化，在其末端添加多聚C，再用引物GSP-2和铆钉引物AAP进行PCR第1轮扩增。反应体系(50 μL): ddH2O 31.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, MgCl2(25 μmol/L) 3 μL, dNTP Mix (10 μmol/L) 1 μL, Nested GSP-2 (10 μmol/L) 2 μL, Abridged Anchor Primer (10 μmol/L) 2 μL, dC-tailed cDNA 5 μL, Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。反应程序: 94℃预变性2 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 10 min, 共35个循环。之后用引物GSP-3与通用扩增引物AUAP进行第2轮巢式PCR。反应体系(50 μL): ddH2O 33.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, MgCl2(25 μmol/L) 3 μL, dNTP Mix (10 μmol/L) 1 μL, Nested GSP-3 (10 μmol/L) 1 μL, AUAP或UAP (10 μmol/L) 1 μL, PCR稀释产物 5 μL, Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。反应程序与第一轮相同。纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序。

基因的3′RACE使用逆转录酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS Primer A对总RNA进行逆转录合成cDNA，之后用引物3′978-1和通用引物UPM配成的50 μL反应体系进行第1轮PCR扩增。扩增产物稀释50倍后，用引物3′978-2和UPM进行第2轮PCR扩增，反应条件及程序同第1轮。将产物进行切胶回收纯化，并与pMD18T连接，转化后送至上海生工直接测序。

最后使用Vector NTI10.3.0软件将测得的5′和3′末端序列和中间序列拼接，得到MaLac1基因的全长cDNA序列，通过NCBI比对分析预测出基因的起始和终止密码子位置。纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序。阳性克隆的测序结果与cDNA序列比对来确定成功获得了重组载体。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

下划线序列GAATTG和CTCGAG分别为MfeⅠ和XhoⅠ酶切位点。The underlined sequences GAATTG and CTCGAG are the cleavage site ofMfeⅠandXhoⅠ, respectively.

1.5 松墨天牛MaLac1基因的生物信息学分析

使用DNAMAN软件对目的基因编码序列进行预测，并用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)对松墨天牛MaLac1基因的最长开放阅读框进行预测。通过ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)等软件完成MaLac1基因编码蛋白理化性质的预测；使用在线SignalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)软件进行信号肽预测；用TMpredServer(https:∥embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)等软件完成对MaLac1基因编码蛋白质的跨膜结构和亲水性预测；用SOPMA(http:∥scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)等软件完成对MaLac1蛋白的二级结构和三级结构预测。通过NCBI检索其他昆虫Lac基因序列，用ClustalW2(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)软件完成氨基酸序列比对，再用MEGA6.0软件构建进化树，并完成1 000次bootstrap统计学检测。

1.6 松墨天牛MaLac1蛋白的原核表达与纯化

利用P1944F(包含MfeⅠ酶切位点)和P1944R(包含XhoⅠ酶切位点)(表1)，以pMD18T-MaLac1质粒为模板，扩增全长CDS(Met1-Leu502)，用MfeⅠ和XhoⅠ酶切后回收，连接至pET-32a载体多克隆位点5′EcoRⅠ-XhoⅠ3′之间。由于Lac基因中含有EcoRⅠ位点，故此处使用其同尾酶MfeⅠ进行载体构建。连接后转化到大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞。测序鉴定PCR筛选后的重组质粒pET32a-MaLac1，并将鉴定好的重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta (DE3)中，进行菌落PCR，之后对质粒进行酶切鉴定。接种阳性克隆Rosetta(pET32a-MaLac1)至LB培养基，保持温度为37℃，在220 r/min条件下震荡过夜培养。 待OD600=0.4～0.6之间时，加入IPTG，最终浓度为0.5 mmol/L，在18℃条件下诱导表达10 h。离心收集经超声破碎至透亮的重组菌体(新芝超声破碎仪，2号探头，功率10%，超声时间2 s，间歇时间2 s，循环进行4 min), 12 000 r/min 10 min离心，分别收集上清和沉淀，12% SDS-PAGE检测融合蛋白可溶性。

将大肠杆菌Rosetta-pET32a-MaLac1菌株诱导后，用裂解缓冲液重悬，超声洗涤离心后获得包涵体，使用8 mol/L尿素将包涵体变性，然后缓慢地将变性后包涵体蛋白加入到复性缓冲液中，获得复性后可溶MaLac1重组蛋白。离心取上清液与Ni-NTA柱结合，用洗涤缓冲液去除杂蛋白，并将目的蛋白从Ni柱上洗脱。用Millipore 15 mL 10 K(UFC910096)的超滤离心柱浓缩目的蛋白MaLac1，SDS-PAGE检测蛋白纯化时的各组分，确定融合蛋白的大小和纯度。

1.7 松墨天牛MaLac1基因表达量的qPCR检测

采用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛低龄幼虫、老熟幼虫、蛹和雌雄成虫肠道中的表达差异，上游引物为D-MaLac1-F，下游引物为D-MaLac1-R(表1)。以1.2节中合成的不同虫态肠道cDNA为模板，选用在松墨天牛不同发育阶段表达较稳定的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因(冯波等, 2016)，其上游引物为D-GAPDH-F，下游引物为D-GAPDH-R(表1)。反应体系(20 μL): Bestar® SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 7 μL。反应程序: 95℃预变性2 min; 94℃变性20 s, 58℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环，记录相关数据。

1.8 数据分析

松墨天牛MaLac1基因表达结果按照2-△△CT方法进行数据处理(Livak and Schmittgen, 2001)，将所得数据用IBM SPSS Statistics 20软件的比较均值单因素方差分析(ANOVA)进行分析，数据以平均值±标准误显示。

2 结果

2.1 松墨天牛MaLac1基因的克隆及序列分析

根据课题组前期获得的松墨天牛转录组测序数据(Wuetal., 2016)，筛选出松墨天牛漆酶保守序列信息，设计并合成引物。提取松墨天牛新鲜肠道组织总RNA(图1: A)，逆转录合成cDNA作为模板，PCR扩增后得到该基因中间片段。根据获得的松墨天牛漆酶基因保守序列分别设计目的基因的5′和3′RACE特异引物，进行PCR扩增克隆测序。根据中间片段序列、5′RACE和3′RACE结果进行序列拼接，获得一条总长为2 395 bp的cDNA序列，其中编码区长度为2 067 bp(图1: B)，5′端非编码区118 bp(图1: C)，3′端非编码区210 bp(图1: D)，命名此基因为MaLac1(GenBank登录号: KY073340)。MaLac1基因编码一个含688个氨基酸的蛋白质，编码蛋白分子量为78.34 kD，等电点为5.30。 信号肽预测结果表明，N端第1-15位氨基酸为信号肽区。MaLac1基因编码多肽的原子组成为C3500H5306N940O1042S35，不稳定系数是31.66，稳定性强。MaLac1基因的编码蛋白有80.15的脂肪系数，总平均亲水性为-0.314，通过软件ProtParam分析表明，MaLac1基因的编码蛋白亲水区域较多，为亲水性蛋白。利用在线TMpred软件对MaLac1基因编码蛋白进行跨膜区分析，结果表明MaLac1基因编码蛋白具有2个跨膜域和1个疑似跨膜域。每个跨膜结构域有17～18个氨基酸残基。使用SOPMA等软件和Swiss-model软件分析MaLac1基因编码蛋白质结构，结果表明MaLac1编码蛋白二级结构中无规则卷曲占比57.99%，α-螺旋占比9.3%，β-折叠占比5.23%，α-螺旋与无规则卷曲间的伸展链占比27.47%,表明三级结构中构成蛋白质的主要骨架为无规则卷曲。

图1 松墨天牛MaLac1基因全长的克隆Fig. 1 Full length cDNA cloning of MaLac1 in Monochamus alternatus1: 松墨天牛肠道总RNA Total RNA of M. alternatus gut; 2: MaLac1基因中间片段Intermediate fragment of MaLac1 (2 067 bp); 3: 5′ RACE片段5′ RACE fragment (167 bp); 4: 3′RACE片段3′ RACE fragment (269 bp); M: DL2000.

2.2 松墨天牛MaLac1蛋白与其他已知昆虫漆酶基因序列比对及系统进化分析

使用ClustalX2.1软件将MaLac1基因和其他15种昆虫漆酶基因编码氨基酸序列(物种名及其漆酶基因GenBank登录号信息见图2图注)进行多重比对，结果显示：MaLac1基因编码产物与其他昆虫漆酶类似，具有与铜离子结合有关的10个组氨酸和1个半胱氨酸，以及一段C-X-R-X-C区域，并在N末端具有若干个芳香族带电残基(Dittmeretal., 2004)；C-X-R-X-C区域一般拥有7个半胱氨酸，位于第一个铜离子结合组氨酸上游90个氨基酸的位置，并且在昆虫漆酶蛋白中高度保守。使用MEGA6.0软件对来源于15个昆虫物种的漆酶基因构建系统进化树(图2)，结果显示，MaLac1基因的氨基酸序列与赤拟谷盗Triboliumcastaneum漆酶基因TcLac1的氨基酸序列一致性为93%，具有较近的亲缘关系；不同物种间Lac1基因与Lac2基因各自形成不同分支，说明同一类型的漆酶基因保守性更强。

图2 邻接法构建的基于松墨天牛漆酶MaLac1和其他昆虫Lac氨基酸序列的系统发育树(1 000次重复)Fig. 2 Phylogenetic tree of MaLac1 of Monochamus alternatus and Lac proteins of other insects based on amino acid sequence(neighbor-joining method, 1 000 repeats)Lac蛋白来源物种及GenBank登录号Origin species of Lac proteins and their GenBank accession numbers: MaLac1: 松墨天牛Monochamus alternatus (KY073340); AnLac1: 光肩星天牛Anoplophora glabripennis (XP_018580038); LdLac1: 马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata (XP_023019016); NcLac1S: 黑尾叶蝉 Nephotettix cincticeps (AB514129); BtLac1: 烟粉虱 Bemisia tabaci (AQY62684); SoLac2: 米象 Sitophilus oryzae (XP_030755871); TcLac1: 赤拟谷盗 Tribolium castaneum (NP 001034514); AmLac1: 西方蜜蜂Apis mellifera (XP_026295929); SiLac1: 红火蚁Solenopsis invicta (XP_025992935); MsLac1: 烟草天蛾 Manduca sexta (AAN17506); HaLac1: 棉铃虫 Helicoverpa armigera (AKH61981); DpLac1: 黑脉金斑蝶 Danaus plexippus (OWR44647); PxLac1: 小菜蛾Plutella xylostella (KR107969); AgLac1: 冈比亚按蚊Anopheles gambiae (AY135184); MaLac2: 松墨天牛Monochamus alternatus (EU093075); TcLac2: 赤拟谷盗 Tribolium castaneum (AAX84202); MsLac2: 烟草天蛾Manduca sexta (AAN17507); RfLac6: 黄肢散白蚁Reticulitermes flavipes (GQ421909).

2.3 MaLac1基因的原核表达

SDS-PAGE电泳分析表明，在IPTG诱导下，含pET32a-MaLac1的大肠杆菌表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带(图3: A)，符合推测大小；Ni柱亲和层析纯化蛋白结果显示与表达蛋白大小一致(图3: B)，通过纯化最终得到复性蛋白(图3: C)。

2.4 MaLac1在不同发育阶段松墨天牛肠道中的表达量

qPCR结果显示，MaLac1基因在松墨天牛肠道中广泛表达，转录水平在不同发育阶段存在显著差异(F=6.82,P<0.05)。松墨天牛低龄幼虫和老熟幼虫肠道中MaLac1的表达水平相近，均显著低于成虫的(P<0.05)；在松墨天牛的蛹期肠道中，MaLac1的表达量增加，但仍显著低于成虫期的(P<0.05)；在松墨天牛的成虫期，MaLac1在雌成虫肠道中的表达量略高于雄成虫的，均显著高于幼虫期和蛹期的(P<0.05)(图4)。

图3 松墨天牛MaLac1的原核表达及蛋白纯化Fig. 3 Prokaryotic expression and protein purification of MaLac1 of Monochamus alternatusA: 重组载体pET32a-MaLac1的诱导表达Expression of pET32a-MaLac1. 1: 未经IPTG的诱导pET32a-MaLac1的表达产物Expression product of pET32a-MaLac1 non-induced by IPTG; 2: IPTG诱导后pET32a-MaLac1的表达产物Expression product of pET32a-MaLac1 induced by IPTG; 3: 上清中pET32a-MaLac1的表达产物Expression product of pET32a-MaLac1 in supernatant solution; 4: 包涵体中pET32a-MaLac1的表达产物Expression product of pET32a-MaLac1 in inclusion body. B: pET32a-MaLac1表达的重组蛋白的纯化 Purification of the recombinant protein expressed by pET32a-MaLac1. 5: 包涵体的裂解沉淀Sediment of inclusion body; 6: 包涵体的裂解上清Supernatant of inclusion body. C: MaLac1纯化蛋白的复性Refolding of purified MaLac1 protein. 7: MaLac1复性蛋白Renaturated protein of MaLac1. M: 蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker.

图4 MaLac1在不同发育阶段松墨天牛肠道中的表达分析Fig. 4 Expression profiles of MaLac1 in the gut ofMonochamus alternatus at differentdevelopmental stagesEL: 低龄幼虫Early instar larva; ML: 老熟幼虫Mature larva; PP: 蛹Pupa; FA: 雌成虫Female adult; MA: 雄成虫Male adult. 图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母分别代表不同虫态肠道中基因表达量的差异显著性(n=3)(P<0.05, LSD法)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level in the gut among different developmental stages (n=3)(P<0.05, LSD method).

3 讨论

本研究通过筛选松墨天牛各发育阶段转录组数据(Wuetal., 2016)，获得了一个松墨天牛内源漆酶基因，并将其命名为MaLac1。通过RACE技术成功获得了MaLac1的全长cDNA，ORF全长2 067 bp，编码一个含688个氨基酸的蛋白质，预测分子量为78.34 kD，等电点为5.30。与其他昆虫漆酶的氨基酸序列比对显示，MaLac1具有与铜离子结合有关的10个组氨酸和1个半胱氨酸、一段C-X-R-X-C密集区域、以及在N末端存在若干芳香族带电残基，这与昆虫漆酶蛋白的典型特征相吻合(Dittmeretal., 2004)。系统进化分析表明该基因氨基酸序列与赤拟谷盗TcLac1基因氨基酸序列的一致性达到93%，具有较近的亲缘关系。昆虫Lac1氨基酸序列与昆虫Lac2氨基酸序列各自形成一个分支，表明同一类型漆酶基因保守性较强。

本研究构建了MaLac1基因的原核表达载体pET32a-MaLac1，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞表达菌株，通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示，最终产生了一条大约78 kD的特异蛋白条带，符合推测大小，表明成功完成了pET32a-MaLac1的表达。最终通过Ni柱亲和层析纯化得到了复性蛋白，为下一步蛋白功能的研究奠定了基础。

漆酶作为一种重要的木质素酶，其降解功能已在其他植食性昆虫中被发现。Coy等(2010)对黄肢散白蚁的漆酶RfLac进行活性测定，发现RfLac对木质素单体芥子酸、邻苯二酚等底物具有催化活性。烟草天蛾进行取食后，其漆酶基因MsLac1在中肠中大量表达，而在虫体休眠后表达量降低，推测MsLac1可能与昆虫木质素降解有关(Dittmeretal., 2004)。在MaLac1表达定量分析中，发现MaLac1在松墨天牛不同发育时期的肠道中广泛表达，在成虫中肠道中的表达量显著高于幼虫和蛹中的，推测其参与了宿主昆虫的基本生理功能，可能在松墨天牛消化木质素的过程中发挥了一定作用。

冈比亚按蚊体内血液含量升高时，漆酶基因AgMCO1在中肠、马氏管、卵巢中的表达量同时上升，表明AgMCO1可能与铁代谢有关(Nicholetal., 2002; Gormanetal., 2008)。黑尾叶蝉漆酶基因NcLac1S在唾液腺中表达显著，推测其可能与酚类化合物解毒有关(Hattorietal., 2010)。小菜蛾漆酶基因PxLac1在虫体受到细菌感染后，转录水平显著提升，也证明了Lac1具有参与昆虫免疫的功能(Wang ZHetal., 2018)。因此，松墨天牛MaLac1可能具有食物脱毒、离子代谢、自身免疫等方面的生理功能。

单宁酸是一种在植物体内广泛存在的天然多元酚化合物(Gardioletal., 1996; Wanetal., 2006)。单宁酸可以与唾液蛋白、糖蛋白等互作，产生苦涩味，从而降低动物采食量，影响蛋白质的消化吸收(邵娅等, 2017);另一方面，漆酶被认为可以通过对单宁酸的氧化作用，提高植食性昆虫对寄主植物的抗性(李芒, 2011)。马尾松健康木中单宁含量较高，而在受到昆虫侵害时，随着危害程度的加深，其单宁含量呈现先增加后降低的趋势(史先慧等, 2017)。松墨天牛多选择衰弱木、枯死木产卵，在幼虫期大量进食，直至羽化；羽化后的成虫则喜好取食健康松树的嫩梢以补充营养。因此，松墨天牛成虫在取食行为中将面临较高的寄主植物抗性压力，其MaLac1基因表达量的升高可能与氧化植物单宁酸，帮助昆虫食物脱毒，克服寄主植物抗性有关。MaLac1在松墨天牛肠道中的具体作用还有待进一步研究验证。

本研究克隆了松墨天牛MaLac1基因全长序列，解析了该基因的结构并预测其编码蛋白生物学特性，完成了原核表达并纯化目的蛋白，荧光定量PCR探明了MaLac1基因在松墨天牛不同生长发育阶段的肠道中的表达差异，研究结果将有助于进一步探究松墨天牛漆酶的功能。