中草药对异育银鲫感染嗜水气单胞菌防治效果的研究

陈 凯 谢 骏，2 吴家玉,2 潘良坤 潘晓川

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214128；3.加拿大经典中医研究院，不列颠哥伦比亚 温哥华 V8W 1Z3)

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种常见的水生动物条件致病菌，由于近年来养殖密度、养殖环境以及药物的不合理使用，使得以嗜水气单胞菌为代表的水生动物细菌性病害频发且不易防治，由此对水产养殖业造成了巨大的经济损失。

目前，中草药及其提取物在水产病原菌体外抑菌研究较多，何爱华等(2011)、张海宾等(2006)、肖辉等(2009)在其研究中均发现黄连等中草药对嗜水气单胞菌具有明显的抑菌作用。然而，一方面由于中草药及其提取物成分组成复杂，其作用同时涉及对病原菌的抑杀和对宿主的免疫机能调节，另一方面从宿主的角度进行药物保护效果的评价更为简单直接，因此学者们更多的是从对宿主的保护率以及免疫功能等方面开展相关评估研究。目前对于中草药有效成分如多糖、苷类和生物碱等，能提高机体免疫力，增强其对病原生物的防御能力的观点已被广泛认同(敖礼林，2017)。但针对学者提出的“中草药及其提取物还具有阻止、限制以及修复病原菌引起的组织损伤的能力，进而使疾病进程最小化，从而实现抵抗感染的致病作用”(赵小然，2017)，这一点在应用中草药开展水产病害防治研究方面的关注尚显不足。而大黄、黄连作为水产细菌性病害防治的常用中草药，为评价大黄、黄连相关组方是否具备这种以特异性组织损伤调控为靶向的作用效果，我们以异育银鲫人工感染嗜水气单胞菌为模型，开展了相关研究。

一、材料与方法

实验所用异育银鲫均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地提供，鱼体健康无伤，活力强，规格(53.6±4.5)克/尾。异育银鲫被随机分入相同型号的养殖桶中，持续增氧，光周期同自然光，水温维持在(28±1)℃，每天投喂3次，投喂量为体重的2.5%。暂养适应1周后开始实验。

实验所使用的嗜水气单胞菌株为本实验室自行分离鉴定。菌株保存在-80℃甘油管中，使用前在营养琼脂平板上划线，28℃过夜培养，挑取单克隆接种营养肉汤培养至对数期，根据预实验结果调整细菌浓度为2.2×106CFU/毫升，按100微升/尾的剂量进行腹腔注射。随机将鱼分为对照组、感染组、预防组、低剂量治疗组和高剂量治疗组，每组包含3个平行处理(即为3个养殖桶)，每个平行15尾鱼。对照组实验开始后不做攻毒处理，不使用药物处理；感染组实验开始后进行攻毒处理，但不使用药物处理；预防组实验开始时先将药物应用到实验鱼所在养殖桶，使药物终浓度为40微升/升，药物处理两小时后进行攻毒处理；低剂量治疗组在实验开始时进行攻毒处理，攻毒处理完成两小时后应用药物处理，使药物终浓度为4微升/升；高剂量治疗组在实验开始时进行攻毒处理，攻毒处理完成两小时后应用药物处理，使药物终浓度为40微升/升。

攻毒后24小时通过尾椎静脉采集血液(每个平行10尾鱼)，5000转/分、5分钟、4℃收集血浆，-20℃保存备用。同时记录攻毒后72小时内的死亡数量(取样鱼不计入死亡数据)及临床症状。使用全自动生化分析仪(迈瑞BS-400)检测异育银鲫血浆乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平，所用血液生化试剂购自上海执诚生物科技有限公司。

实验数据用SPSS 18.0统计软件包中的单因素方差分析，检验各组间的差异，不同的字母表示各组之间比较差异显著(P＜0.05)。

二、结果

1.临床症状及死亡率

对照组鱼类无明显异常，体表未出现发病症状，而实验组(感染组、预防组和治疗组)的发病鱼都出现肛门红肿、体表有出血和肿胀现象，解剖可见腹腔内偶有腹水、肠道内无食物，内脏有不同程度充血现象(图1)。

图1 感染异育银鲫的临床症状

对照组72小时存活率为100%，感染组72小时存活率为73.3%，预防组72小时存活率为77.8%，低剂量治疗组A 72小时存活率为86.7%，高剂量治疗组B 72小时存活率为80.0%(图2，表1)。预防组和治疗组的存活率均高于感染组，其中低剂量组的存活率最高。药物保护效率分析结果显示，低剂量组保护效果最佳，保护效率为50%。

图2 不同处理方案下异育银鲫的存活情况

表1 不同处理方案下异育银鲫的死亡情况(n=15)

2.ALT、AST、LDH检测结果及组织细胞损伤评价。

ALT检测结果(图3)显示，感染组血浆ALT活性显著高于对照组(P＜0.05)，而不同药物处理方案干预后，其ALT活性与对照组无统计学差异(P＞0.05)。由此表明，嗜水气单胞菌对异育银鲫体内组织器官造成了损伤，而上述药物处理方案能明显改善这一损伤的状态，而不同处理方案在ALT水平上未表现出明显的差异效果(P＞0.05)。

图3 不同处理方案下对谷丙转氨酶的影响

血浆AST活性(图4)在各组之间的变化并不显著(P＞0.05)，一方面可能细菌感染并未引起组织器官的细胞出现损伤相关，另一方面也显示出该药物的不同应用方案可能对细胞损伤无明显的保护作用。

图4 不同处理方案下对谷草转氨酶的影响

LDH检测结果(图5)表明，感染组血浆LDH活性与对照组相比出现了显著升高(P＜0.05)，由此可见嗜水气单胞菌感染造成了机体组织细胞的损伤，而这种损伤在预防和治疗处理时均能得到有效的改善，其中低剂量治疗处理和对相关指标改善稍差，但与其他两种处理方案结果无显著差异(P＞0.05)。

图5 不同处理方案下对乳酸脱氢酶的影响

三、讨论

近年来，由于细菌耐药问题，使用抗生素防治水生动物细菌性病害的传统手段处境艰难，中草药在国内应用于疾病防治历史悠久，但由于中草药长期以来依赖于传统中医理论发挥其防治疾病的作用，并不能很好地被西医理论体系所阐明，而其作为新型绿色渔药研究的方向，应用现代西医理论阐明其防治疾病的机理对于其推广应用以及深入开发中草药资源具有重要意义。目前关于中草药治疗疾病的研究主要涉及3个方面，其一是中草药直接与病原菌作用，主要表现为抑菌、抑制毒力等方面的作用；其二是中草药对宿主免疫系统的调节作用，进而间接作用于病原菌；其三是中草药能对疾病进程进行干预，通过限制、修复疾病进程中的组织细胞损伤，进而实现对疾病的治疗。

ALT、AST以及LDH均存在于细胞内，但是在不同细胞中的含量不同。细胞损伤时释放到血液中，进而造成血液中相关指标升高。目前人类医学检测中常常将血清ALT和AST水平用来评价肝脏的健康状态，而血清LDH水平则常常用来诊断心肌性疾病，但是鱼类相关研究中尚未明确指出ALT、AST和LDH和具体组织器官之间健康状态的关联性。不过，血清中ALT、AST和LDH与机体细胞损伤之间的关联是毋庸置疑的，本研究以此作为前提，开展了对大黄、黄连相关组方对宿主组织损伤调控方面的研究，结果表明大黄、黄连相关组方确实存在对宿主组织损伤的改善作用，但是从不同方案处理后的死亡情况来看，预防处理的效果不理想，可见这种作用对于药物应用的时机把控十分重要，而关于具体应用时机的定性，仍然需要大量的基础研究。