载脂蛋白E影响星形胶质细胞基质金属蛋白酶-9表达的机制研究

蓝 岚，黄 帆，唐玉兰，张栋亮，刘秋红，罗春芳

多发性硬化( Multiple Sclerosis，MS)的致病机制之一是血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)的屏障作用受到破坏，很多研究已证实BBB破坏与基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases 9，MMP-9)过度表达有关。载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)在中枢神经系统(Central nervous systerm，CNS)中主要由星形胶质细胞分泌，具有脂质转运、神经保护、调节免疫[1]等生物学作用。核转录因子-κB (NF-κB)与细胞免疫应答、炎症反应、增生、转化以及细胞的凋亡等病理生理过程密切相关。在周细胞中，ApoE能通过亲环素A-NF-κB途径影响MMP-9的表达[2]。有研究表明肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可以上调骨髓源性肥大细胞MMP-9的表达[3]，许多研究也发现TNF-α可以刺激MMP-9释放。我们课题组前期研究发现，ApoE可通过调节星形胶质细胞分泌炎症因子影响MMP-9的表达从而影响血脑屏障的完整性[4]，目前ApoE影响星形胶质细胞MMP-9表达的具体机制尚不清楚。本研究旨在探索ApoE、TNF-α、NF-κB及MMP-9之间的关系，研究ApoE影响星形胶质细胞MMP-9表达的可能机制，为多发性硬化的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级C57BL/6J小鼠(动物许可证号：[CXK(京)2009-0004])饲养于广西医科大学动物中心，繁殖1-2d龄的野生型(WT)乳鼠和ApoE基因敲除型(ApoE-/-)乳鼠。

1.1.2 主要试剂 兔抗小鼠GFAP多克隆抗体购自美国abcam公司；山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗购自美国SANTA公司；兔抗小鼠p65多克隆抗体购自美国CST公司；4%多聚甲醛、Triton-X-100购自北京索莱宝有限公司；胎牛血清、DMEM/F12培养基购自南美洲Gibco公司；小鼠TNF-αELISA试剂盒购自武汉华美公司；小鼠MMP-9ELISA试剂盒购自武汉博士德公司；TNF-α购自美国PeproTech公司；siRNA慢病毒购自上海吉凯基因有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原代星形胶质细胞培养 参考Marignier等[5]方法，分别取新生24～48 h 的WT和ApoE-/-乳鼠，消毒麻醉后，断头取脑，预冷的D-Hanks液冲洗数次，尽可能完全剥除大脑皮质的脑膜及血管，快速剪碎后用胰酶37℃消化约10min。用含有血清的DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打，用200目筛网过滤后，1000 r/min离心5 min，加入含15%血清的DMEM/F12培养基重悬，接种入T25培养瓶中，置于培养箱中静置48 h之后换液，以后每2 d换液一次。培养7～10 d待细胞分层生长后，置于37℃摇床中以250 r/min振荡18 h，弃上清液，用D-Hanks液反复洗涤，0.25%胰酶消化2min，用含血清培养基中止，接种于培养瓶。

1.2.2 星形胶质细胞鉴定 原代星形胶质细胞传代3次后，采用免疫荧光染色鉴定GFAP的表达。随机取3张片，每张片随机选3个不同视野计算星形胶质细胞的纯度，其纯度>90%以上符合实验要求。

1.2.3 细胞分组及干预 将WT和ApoE-/-乳鼠星形胶质细胞分别分为空白对照组(Control组)、阴性空载组(NC组)和阳性沉默组(KD组)，分别将传至第三代或者第四代的细胞消化重悬后接种至六孔板。采用感染复数(multiplicity of infection，MOI)为50的病毒滴度进行干预，KD组加入1 ml含阳性慢病毒LV-Rela-RNAi及ploybrene的培养基，NC组加入1ml含阴性慢病毒LV-Rela-RNAi及ploybrene的培养基，Control组加入1ml不含慢病毒及ploybrene的完全培养基，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。转染12h后更换成普通完全培养基，继续培养72 h后，在暗室中用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)表达。收集细胞培养上清液用于MMP-9和TNF-α浓度检测，收集细胞用于Western blot检测NF-κB/p65蛋白的表达。再用TNF-α刺激上述各组细胞，用完全培养基将TNF-α稀释成终浓度为50ng/ml，六孔板中每孔加入1 ml 稀释后的TNF-α培养液，置于细胞培养箱中培养，并分别于加入TNF-α培养液前及加入TNF-α培养液24h后收集细胞培养上清液，进行MMP-9浓度检测。

1.2.4 Western blot检测NF-κB/p65蛋白表达 在收集的各组星形胶质细胞中加入细胞裂解液裂解细胞，离心后取上清液即为细胞总蛋白。用超微量样本分光光度计测量蛋白浓度。将蛋白进行10%SDSP凝胶电泳，将电泳分离后的蛋白转移至PVDF膜；用5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入p65一抗(1∶1000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次后，加荧光二抗室温避光孵育2 h，TBST洗膜后进行扫膜，用红外线扫描Odyssey成像系统采集条带图像，用 Image J软件对条带进行灰度值测量。

1.2.5 ELISA法检测MMP-9、TNF-α和TNF-α刺激前后各组细胞MMP-9的含量 从各组细胞培养液中各吸取50ul，滴入MMP-9ELISA检测试剂盒中检测MMP-9浓度，再使用相同方法对TNF-α浓度也进行检测。

2 结 果

2.1 星形胶质细胞鉴定 使用GFAP(绿色)对传代纯化至第三代的星形胶质细胞进行免疫荧光染色，并用DAPI(蓝色)进行复染，结果显示两种乳鼠的星形胶质细胞的纯度均>90%以上(见图1)。

2.2 慢病毒转染星形胶质细胞的鉴定 倒置荧光显微镜下观察，绿色表示携带绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA-p65表达，结果显示超过70%的星形胶质细胞转染成功(见图2)。

2.3 NF-κB/p65蛋白表达 无论是ApoE-/- 还是WT星形胶质细胞，KD组p65蛋白表达较Control组均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)，Control组与NC组p65蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。说明siRNA慢病毒显著抑制了两种星形胶质细胞中NF-κB/p65的表达。

2.4 各组星形胶质细胞MMP-9浓度比较 无论是ApoE-/- 还是WT星形胶质细胞，KD组细胞培养基上清液中MMP-9的浓度显著低于Control组和NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；Control组和NC组MMP-9的浓度无显著差异(P>0.05)。在Control组和NC组中，ApoE-/-星形胶质细胞 MMP-9的浓度高于WT星形胶质细胞(P<0.05)(见图4)。

2.5 各组星形胶质细胞TNF-α浓度比较 无论是ApoE-/- 还是WT星形胶质细胞，与Control组比较，KD组星形胶质细胞培养基上清液中TNF-α浓度显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；Control组和NC组TNF-α浓度无显著差异(P>0.05)。在Control组和NC组中，ApoE-/-星形胶质细胞TNF-α的浓度高于WT星形胶质细胞(P<0.05)(见图5)。

2.6 TNF-α刺激前后各组星形胶质细胞MMP-9浓度比较 不管是刺激前还是刺激后，KD组星形胶质细胞MMP-9浓度均明显低于Control组(P<0.05)；而Control组和NC组MMP-9的浓度无显著差异(P>0.05)；刺激后，Control组和NC组细胞MMP-9的浓度明显升高(P<0.05)，而KD组细胞MMP-9的浓度无明显变化(P>0.05 )(见图6)。

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型

图1 ApoE-/-和WT小鼠星形胶质细胞GFAP的免疫荧光(×100)

Control：空白对照组；LV-NC-P65：阴性空载组；LV-siRNA-P65：阳性沉默组

图2 星形胶质细胞慢病毒转染效果(×40)

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；A：各组条带从左到右依次为KD组、NC组、Control组；B：各组星形胶质细胞P65蛋白相对表达量，无论是ApoE-/- 还是WT星形胶质细胞，与Control组比较，aP<0.05

图3 各组星形胶质细胞p65蛋白的表达

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；MMP-9：基质金属蛋白酶-9；与WT星形胶质细胞相比，aP<0.05；与Control组比较，bP<0.05

图4 各组星形胶质细胞MMP-9的浓度比较

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；与WT星形胶质细胞相比，aP<0.05；与Control组比较，bP<0.05

图5 各组星形胶质细胞TNF-α的浓度比较

ApoE-/-：载脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；MMP-9：基质金属蛋白酶-9；在Control组和NC组中，与TNF-α刺激前比较，aP<0.05；在KD组中，与TNF-α刺激前比较，bP>0.05

图6 TNF-α刺激前后各组星形胶质细胞MMP-9的浓度比较

3 讨 论

ApoE在CNS内主要由星形胶质细胞合成和分泌，是CNS内主要的载脂蛋白，具有介导脂质转运、参与神经修复、抗炎和调节免疫应答等生物学作用，在多发性硬化等神经系统疾病中发挥重要作用。内源性ApoE能降低CNS炎症反应和氧化应激反应程度，从而发挥神经保护作用[6]。ApoE缺乏会加重实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的炎性细胞浸润，而ApoE拟肽干预则可减少炎性细胞浸润[7]，ApoE拟肽还能抑制EAE的CNS内促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-12和IL-6的表达[8]。我们前期在对脾脏淋巴细胞的研究中，发现ApoE可抑制脾脏淋巴细胞TNF-α、IL-17和MMP-9的表达[9]，而Bell等研究表明ApoE结合低密度脂蛋白受体结合蛋1( LRP1)后会减少炎性因子亲环素A-NF-κB的信号通路转导来抑制MMP-9表达[2]，另有研究报道ApoE3可能通过抑制NF-κB/MMP-9途径减少BBB破坏从而改善创伤性脑损伤的预后[10]。由此表明，ApoE可抑制炎症因子表达及可能通过NF-κB信号通路抑制MMP-9表达，从而发挥神经保护作用。

在CNS中，NF-κB家族是许多生理病理过程的关键参与者，NF-κB家族主要包括NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB和c-Rel5个成员，p65是NF-κB关键的功能活性亚基。我们采用siRNA慢病毒沉默WT和ApoE-/-星形胶质细胞NF-κB p65基因，抑制NF-κB信号通路传导，对各组WT和ApoE-/-星形胶质细胞的培养液MMP-9和TNF-α浓度进行对比研究，结果KD组星形胶质细胞MMP-9和TNF-α的浓度均显著低于Control组和NC组，而Control组和NC组之间无明显差异，说明抑制星形胶质细胞NF-κB信号通路可减少影响BBB的关键因素MMP-9和促炎性因子TNF-α的分泌，同时表明NF-κB信号通路对MMP-9和TNF-α的产生有重要作用。与我们研究结果类似的是，Brambilla R等研究表明抑制星形胶质细胞NF-κB信号传导可降低趋化因子的表达和减少白细胞进入受损的CNS[11]，两者均表明抑制NF-κB信号传导可以起抗炎作用。Ha SH等研究表明七叶皂苷通过NF-κB信号途径抑制MMP-9表达从而抑制结肠癌细胞迁移和生长[12]，另有研究报道促炎细胞因子IL-17A通过NF-κB的信号通路上调MMP-2和MMP-9的表达来促进食管腺癌转移[13]，这些研究也表明NF-κB信号通路对MMP-9的产生有重要作用，支持我们的研究结果。我们还发现，ApoE-/-较WT星形胶质细胞MMP-9和TNF-α的表达更高，而抑制NF-κB信号通路后，这两种星形胶质细胞MMP-9和TNF-α的表达无明显差异，表明ApoE可抑制星形胶质细胞MMP-9和TNF-α的表达，且可能通过NF-κB信号通路发挥作用。本次实验完善我们课题组前期发现ApoE可通过抑制星形胶质细胞MMP-9的表达从而维持血脑屏障完整性[14]的部分作用机制。

人和小鼠炎症中最重要的转录特征之一是NF-κB途径的激活，NF-κB在炎症、免疫反应、细胞周期和细胞存活中发挥重要作用，而TNF-α是其经典途径激活的诱导因素。Oku等研究表明TNF-α可以刺激腹膜间皮细胞分泌MMP-9[15]，另有研究发现TNF-α通过刺激人牙龈角质形成细胞产生MMP-9从而使E-钙粘链接蛋白降解[16]，这些研究表明促炎性因子TNF-α对MMP-9有促生成作用。那么在CNS中，促炎性因子TNF-α是否通过星形胶质细胞中NF-κB信号通路上调MMP-9表达来增加BBB通透性呢？为了验证，我们用TNF-α刺激各组星形胶质细胞24h，结果发现刺激后Control组和NC组MMP-9表达升高，而KD组MMP-9表达无明显变化，表明TNF-α可能是通过NF-κB信号通路刺激星形胶质细胞MMP-9的释放，因此我们推测，TNF-α在CNS中可能通过NF-κB信号通路诱导星形胶质细胞释放MMP-9，从而增加BBB的通透性。综合整个研究结果，我们推测，ApoE可能通过NF-κB信号通路抑制星形胶质细胞TNF-α的分泌，减少TNF-α通过NF-κB信号通路对MMP-9的促生成作用，从而抑制MMP-9的表达，即ApoE可能通过TNF-α/NF-κB信号通路影响星形胶质细胞MMP-9的表达，从而影响血脑屏障的完整性。值得注意的是，我们体外培养WT和ApoE-/-星形胶质细胞，独立研究内源性ApoE影响星形胶质细胞MMP-9表达的机制，避免了体内研究中小胶质细胞、内皮细胞等其他细胞的影响。

综上所述，我们发现ApoE可能通过TNF-α/NF-κB信号通路影响星形胶质细胞MMP-9的表达，从而影响血脑屏障的完整性，进一步明确了ApoE在多发性硬化中的作用机制，为多发性硬化的治疗提供参考依据。ApoE不仅能抑制星形胶质细胞TNF-α的表达，还能抑制IL-1β、IL-12和IL-6等促炎性因子的表达，因此，ApoE还可能通过其他的促炎性因子及炎症信号通路影响星形胶质细胞MMP-9表达，其具体机制有待进一步研究。