贵州黑山羊BMP15基因多态性及生物信息学分析

李平 李潇蒙 龙清孟

关键词：贵州黑山羊;BMP15;SNPs;生物信息学

骨形态发生蛋白15（BMP15）又称生长分化因子9B，不仅能够促进颗粒细胞分裂、分化，而且能够抑制颗粒细胞中FSHR基因的表达[1]，同时能够促进卵泡发育[6-7]。BMP15基因由1个内含子与2个外显子构成，2个外显子被内含子隔开，外显子全长1 176 bp，共编码393个氨基酸残基的前蛋白。通过大量研究发现，BMP15基因可能与高繁殖性状有关，研究人员已在国内优良地方品种的绵羊上对BMP15基因展开相关研究，以期为构建高繁殖力群体奠定基础。目前，已在少数绵羊品种上发现BMP15基因与繁殖性状有关联，在小尾寒羊上发现BMP15基因B2处突变对高繁殖性状影响作用十分明显[4-5]。程俐芬等人研究发现BMP15基因在第一外显子中虽存在突变位点，但对绵羊繁殖性状并没有显著影响[3]。吴翠玲等研究6个绵羊群体发现，BMP15基因外显子1上在58～60 bp处有3个碱基（CTT）缺失[1]。本研究通过PCR产物直接测序技术并结合生物软件对贵州黑山羊BMP15基因进行多态性研究与生物信息学分析，预测mRNA二级结构、蛋白质二级结构、三级结构，以期为今后研究贵州黑山羊繁殖性状提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 血液DNA提取

102只贵州黑山羊血液样本，来自册亨县冗渡镇贵州领头羊山地草牧业科技有限公司。血液DNA提取采用天根血液基因组DNA提取试剂盒，提取后用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行检测，检测结果发现条带清晰明亮、无RNA和蛋白质等污染。通过微量紫外分光光度计检测DNA质量D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之间，说明DNA提取效果好，纯度高。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI数据库中绵羊BMP15基因序列（登录号：NM_001114767.1）利用Primer 5.0软件设计2对引物，其目的片段覆盖全部外显子区域，引物序列见表1。引物合成由上海英潍捷基贸易有限公司完成。

1.3 PCR扩增

贵州黑山羊基因组DNA采用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20.0 μL：PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA2.0 μL，蒸馏水5.0 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，退火（退火温度见表1）30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR扩增产物用1%;琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PCR扩增产物测序和基因序列分析

PCR扩增产物，送往上海英潍捷基贸易有限公司进行双向测序。测序结果利用SeqMan软件进行序列分析，采用MWSnap测量SNPs等位基因的峰高值，根据Ai=Bi/（Ba+Bb），i=a，b公式估算各等位基因频率。利用生物信息学软件进行mRNA二级结构预测，蛋白质二级、三级结构预测。

2 结果与分析

2.1 DNA检测结果

采用1%的琼脂糖凝胶电泳对血液DNA进行检测，电泳结果显示基因组条带整齐、清晰明亮、无RNA和蛋白质等污染，并利用紫外分光光度计测量D260 nm/280 nm均在1.8～2.0范围内。检测DNA结果表明提取的DNA可用于PCR扩增。

2.2 PCR扩增产物检测结果

以5 μL扩增产物为样本用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，以1 000 bp DNA Ladder Maker作为分子量标记对照。检测结果见图1，PCR扩增产物条带整齐、清晰明亮、检测片段长度与目的片段一致，其扩增目的片段长度分别为632 bp和920 bp，表明2对引物的特异性较好。

2.3 扩增基因的测序

测序结果利用SeqMan软件查看，找到1个SNP位点，由图2可知，在第二外显子6 260 bp处发生C→G突变，exon2-C 6 260 bp，利用DNAStar中的EditSeq软件进行分析发现，BMP15基因编码的蛋白质突变前后发生改变，由Gln突变为Glu，第二外显子上的突变为错义突变。

2.4 SNPs等位基因频率估算

BMP15基因SNPs等位基因的峰高值利用MWSnap软件进行测量，将其测量值代入公式，利用公式估算出突变前后等位基因频率，突变前为0.485，突变后为0.515，数据结果显示突变前后有差异。

2.5 BMP15基因mRNA二级结构分析

利用EditSeq软件进行mRNA二级结构分析发现，BMP15基因mRNA的序列在突变前后翻译的氨基酸序列不同，使得mRNA结构改变。利用http：//rna.tbi.univie.ac.at-bin/RNAfold.cgi软件进行mRNA二级结构预测，发现其突变前后的自由能均为-1 201.75 kJ/mol，突变前后具体的二级结构见图3。

2.6 BMP15的蛋白质理化特性分析

依照BMP15基因所编码的氨基酸序列，通过http：//us.expasy.org/tools/protparam.html在线进行蛋白质理化特性分析。由表3可知，BMP15基因分子式突变前为C1828H2779N515O494S14，突变后为C1828H2778N514O495S14，在酵母菌中的半衰期突变前后均大于3 min，在人体外红细胞中半衰期突变前后均大于2.8 h，该蛋白属于不稳定性蛋白。利用Antheprot 63分析软件对BMP15蛋白的亲水性和易溶性进行分析，由图4、图5可知，BMP15蛋白的亲水指数范围为-1.91～2.72;易溶性较强，皆为正数，最大易溶性为3.97。综上分析，BMP15蛋白整体上表现为亲水性。利用在线跨膜蛋白数据库对BMP15的跨膜区域进行分析，由图6可知，实线表示跨膜方向由膜内向膜外，虚线表示跨膜方向膜外向膜内，2种跨膜方向皆是由正数到负数再到正数的顺序，此蛋白具有跨膜结构。

2.7 BMP15蛋白质二级结构分析

https：//npsa-pr-abi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_Sopma.html网页在线进行蛋白质二级结构预测;结果显示，α-螺旋（Alpha helix）、β-转角（Beta turn）、扩展链、 无规卷曲在突变位点前后均有改变（表4）。利用Protean软件对BMP15蛋白质二级结构进行预测（图7）。

2.8 BMP15蛋白质三级结构分析

http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index网页在线进行蛋白质三级结构预测，分析显示突变前和突变后的变化具体结构，见图8。

3 讨论

近年，研究人员不断地挖掘BMP15基因突变位点[8-9]，并且有研究发现BMP15基因是控制绵羊高繁殖性状的主效基因之一[10-11]，目前已在Inverdale绵羊、Hanna绵羊和Lacaune绵羊等国外品种中发现BMP15基因与产羔性状相关的多个不同突变位点[15]。田志龙等人在绵羊上对BMP15基因进行多态性研究，发现g.50971423T > C位点处存在3种基因型，分别是TT、TC和CC，在单羔和多羔品种间其基因型频率和等位基因频率均差异显著（P<0.05）[12]。胡珊等对山羊BMP15基因进行生物信息学分析，发现山羊BMP15基因编码区长 1 185 bp，编码394个氨基酸，BMP15蛋白是一个具有亲水性的不稳定的碱性蛋白[2]。何远清等在6个山羊品种中找到了B4突变[13]，林尖兵等也在贵州白山羊中找到了B4突变[14]。

本研究发现贵州黑山羊BMP15基因在第二外显子6 260 bp处发生C→G突变。朱韶华等研究发现BMP15第二外显子第755位点发生的T→C突变（AC型）对蒙古羊1胎产双羔影响十分显著[16]。通过生物信息学分析，结果显示，BMP15基因突变前后所编码的氨基酸序列发生改变，此突变为错义突

变;BMP15蛋白为具有跨膜结构的亲水性不稳定性蛋白。胡珊等研究发现，BMP15蛋白是一个不稳定的碱性蛋白[2]。本研究在BMP15基因上也有同样的发现。有研究表示，BMP15第二外显子的突变可能与动物繁殖性状相关，本研究在第二外显子上找到突变位点，后续将结合第二外显子突变与繁殖性状作进一步的研究，以期为今后与性状相关联研究提供理论依据。

参考文献：

[1]吴翠玲，宗兴龙，赵 卓，等. 6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析[J]. 中国畜牧兽医，2018，45（8）：2236-2246.

[2]胡 姗，方 乾，李 浩，等. 山羊BMP15基因生物信息学分析[J]. 家畜生态学报，2018，39（8）：13-19.

[3]程俐芬，姬爱国，王清祥. 骨形态发生蛋白BMP15基因与绵羊繁殖性能关系的研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2017，44（8）：2392-2397.

[4]储明星，成 荣，陈国宏，等. 小尾寒羊和湖羊高繁殖力候选基因BMP15的研究[J]. 安徽农业大学学报，2005，32（3）：278-282.

[5]黄顺国，额尔和花，王新燕等. 绵羊多胎基因BMPR-1B、BMP15的研究进展[J]. 农业科学研究，2007，28（3）：68-71.

[6]Peng J，Wigglesworth K，Rangarajan A，et al. Aminoacid 72 of mouse and human GDF9 mature domain is responsible for homodimer bioactivities but has subtle effects on GDF9：BMP15 heterodimer activities[J]. Biology of Reproduction，2014，91（6）：142.

[7]Paulini F，Melo E O. The role of oocyte-secreted factors GDF9 and BMP15 in follicular development and oogenesis[J]. Reproduction in Domestic Animals，2011，46（2）：354-361.

[8]Lassoued N，Benkhlil Z，Woloszyn F，et al. Fec XBar： a novel BMP15 mutation responsible for proli？cacy and female sterility in Tunisian Barbarine Sheep[J]. BMC Genetics，2017，18（1）：43-53.

[9]董新龙，胡文萍，贺小云. 等绵羊BMP15组织表达特征及Fec XGr、Fec XO 和 G971A 突变的检测[J]. 农业生物技术学报，2016，24（12）：1810-1819.

[10]Galloway S M，Mc N P，Cambridge L M，et al. Mutations in an oocyte-derived growth factor gene（BMP15）cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-sensitive manner[J]. Nature Genetics，2000，25（3）：279-283.

[11]Hanrahan J P，Gregan S M，Mulsant P，et al. Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep（Ovis aries）[J]. Biology of Reproduction，2004，70（4）：900-909.

[12]田志龍，刘秋月，王翔宇，等. 绵羊BMP15基因多态性及其与产羔数的关联分析[J]. 中国畜牧杂志，2018，54（7）：23-27.

[13]何远清，储明星，王金玉，等. 6个山羊品种高繁殖力候选基因BMP15多态性研究[J]. 安徽农业大学学报，2006（1）：61-64.

[14]林尖兵，杜智勇，覃 成，等. 贵州白山羊BMP15基因多态性研究[J]. 畜牧与兽医，2007（12）：21-24.

[15]朱 兰，兰 蓉，邵庆勇，等. 云南黑山羊新品种和龙陵黄山羊高繁基因的研究[J]. 畜牧与兽医，2018，50（2）：1-6.

[16]朱韶华，张利平，马晓明，等. 3种绵羊BMP15基因第二外显子多态性及与产羔数的相关性分析[J]. 基因组学与应用生物学，2019，38（1）：74-81.赵 位，喻 东，程建国，等. 林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子的原核表达[J].