一株产纤维素酶细菌的发酵产酶条件优化

郭建华 张春强 郭宏文

关键词：产纤维素酶细菌;FPA酶;CMC酶;发酵条件优化

能源、环境及工农业原料生产等问题越来越影响着人们的日常生活，高产纤维素酶微生物的筛选对解决这些问题都十分重要[1-3]。大多数细菌所产纤维素酶与真菌来源的酶性质不同，某些方面具有真菌酶不可替代的作用[4]。細菌纤维素酶在饲料工业、洗涤剂工业及纺织工业中具有广泛的利用前景，因此在工业生产中的地位逐渐提高[5]，其中产纤维素酶的芽孢杆菌成为近年来的研究热点[6]。本试验以从白酒酒醅中选育得到的产纤维素酶细菌菌株DM-4为试验菌株，利用单因素试验和响应面试验设计，优化其发酵产酶条件，为进一步的试验研究准备条件。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

菌株DM-4，由笔者所在实验室从白酒酒醅中选育得到，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

1.2 培养基

种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH值7.5～7.6，121 ℃下灭菌30 min。发酵培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨2.5 g，酵母浸出汁 1.0 g，NaCl 2.5 g，KH2PO3 0.5 g，硫酸镁0.1 g，琼脂10 g，去离子水500 mL，121 ℃下灭菌30 min。

1.3 纤维素酶活力测定方法

待测发酵液倒入离心管中，5 000 r/min离心 10 min，取上清液测定酶活。滤纸酶（FPA酶）活力测定：根据国际理论应用化学协会（IUPAC）的方法测定[7]。CMC酶活力测定见参考文献[8]。

1.4 菌株液体发酵产酶条件的优化

1.4.1 发酵时间的确定 发酵培养基内接入种子后，从12 h开始，每12 h取样测定酶活，直到72 h。

1.4.2 接种量的确定 按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量将种子液接入发酵培养基中，于37 ℃、摇瓶转速200 r/min的条件下发酵36 h后测酶活力。

1.4.3 培养基成分的优化

1.4.3.1 碳源的优化 （1）碳源种类的优化：以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、麸皮（过80目筛）、玉米粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉和微晶纤维素作为唯一碳源（2%）配制培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。（2）碳源浓度的优化：在优化碳源种类后，配制碳源浓度为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、35%和4%的发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。

1.4.3.2 氮源的优化 （1）氮源种类的优化：优化碳源后，以蛋白胨、豆饼粉（过80目筛）、大豆蛋白粉、硫酸铵、硝酸钾和尿素作为唯一氮源（0.5%）配制发酵培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。（2）氮源浓度的优化：在优化氮源种类后，配制优化氮源浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和11%发酵培养基，接入种子后发酵36 h后测酶活力。

1.4.3.3 初始pH值的优化 分别配制pH值4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0碳氮源优化后发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。

1.4.3.4 磷酸盐浓度优化 配制K2HPO3浓度为01%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的上述条件优化后的发酵培养基，接入突变菌株发酵36 h后测酶活力。

1.4.4 响应面设计试验 在上述优化基础上，根据Box-Behuken设计方法，采用minitab 16构建3因素（碳源浓度、氮源浓度和磷酸盐浓度）3水平响应面分析[9-10]。

1.4.5 统计分析 利用SPASS软件实现统计分析及差异显著性检验[11]。

2 结果与分析

2.1 发酵时间的确定

接入种子液后，从发酵12 h开始每隔12 h测定FPA酶活和CMC酶活，直到发酵后72 h，结果如图1所示。发酵时间为36 h时，菌株产FPA酶和CMC酶都表现出了比较高的酶活力，继续发酵到48 h会有少许增加，之后逐渐下降。经差异显著性检验，发酵36 h酶活与发酵48 h酶活差异不显著（P>0.05），而与其他发酵时间的酶活差异极显著（P<0.01），确定36 h为最优发酵时间。

2.2 接种量的确定

不同接种量下菌株发酵产酶结果见图2。随接种量提高，菌株产酶活力不断提高。接种量大于4%时，酶活提高量变小。经差异显著性检验，4%、5%和6%这3种接种量条件下的酶活差异不显著（P>0.05），综合考查，选择4%的接种量为优化条件。

2.3 初始pH值的优化

菌株DM-4在不同初始pH值条件下发酵产纤维素酶活力结果见图3。试验结果显示，初始pH值为5.5～6.0时，菌株DM-4产酶活性最高。显著性检验结果表明，初始pH值5.5条件下菌株所产酶活与初始pH值6.0条件下差异不显著（P>005），而与其他初始pH值条件下差异极显著（P<0.01），因此，确定最优产酶初始pH值为5.5～6.0。

2.4 培养基组分的优化

2.4.1 碳源的优化 分别利用不同碳源作为唯一碳源配制培养基进行发酵，结果见图4。总体分析，含有纤维素物质的碳源比不含纤维素物质的碳源所产酶活高。其中以麸皮为唯一碳源时产酶能力最强，与其他碳源比较差异极显著（P<0.01），确定麸皮为最优碳源。由图5可知，当麸皮浓度在 2.5% 以下时，随着麸皮浓度升高，酶活升高，超过2.5%时，酶活反而下降。在碳源浓度为2.5%时菌株所产酶活与其他浓度下所产酶活比较具有显著性差异。碳源浓度过低会造成营养不足，能源物质少，细胞不能生成足够的ATP满足菌体的生长代谢，菌体生长不良，产酶活性低;而碳源浓度过高时，能源物质充足，细胞生长快，同时发酵液黏度升高，溶氧不足，使细胞产酶量下降，降低活性。在本试验条件下选择麸皮浓度2.5%作为优化碳源浓度。

2.4.2 氮源的优化 分别以不同物质作为唯一氮源进行发酵试验，结果见图6。总体而言，有机氮源产纤维酶酶活性要比无机氮源稍高。差异显著性检测表明，蛋白胨、豆饼粉和大豆蛋白粉作为氮源时，其酶活之间差异不显著（P>005），而与硫酸铵、硝酸鉀和尿素作为氮源时的产酶活性差异极显著（P<0.01）。由于试验菌株是在酒醅中筛选出来的，经常年不断优化，适应了有机氮源的营养，同时，有机氮源中所含的营养，除氮源外还有其他营养成分，会促进菌体产酶。综合考虑，本试验以蛋白胨作为最佳氮源。氮源浓度优化试验结果（图7）显示，随氮源浓度增加，菌株产酶活力增加，当氮源浓度为0.9%时，菌株产酶活力最高，氮源浓度继续提高至1.1%后，酶活力少许下降。氮源是细胞合成产物的重要物质，数量过少，产物合成不足，数量过多，有可能造成底物抑制，细胞合成酶的数量降低，从而使菌体产酶活性降低。通过0.9%浓度时的酶活力与其他氮源浓度下的酶活力差异性比较可知，氮源浓度0.9%时，FPA酶活和CMC酶活与其他浓度下的酶活具有显著性差异（P<0.05），因此，选择氮源浓度为0.9%作为优化浓度。

2.4.3 磷酸盐浓度的优化 配制磷酸盐浓度分别为0.1%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的培养基，接入菌株后进行发酵，36 h后测定纤维素酶活力，结果见图8。当磷酸盐（KH2PO3）浓度为 0.5% 时，菌株所产酶活最高。浓度进一步增加后，酶活反而下降。磷酸盐浓度很小时，磷元素不足造成细胞代谢缓慢，磷酸盐浓度过高，会引起细胞生长过快，导致营养物质只合成细胞而不产酶。显著性检验表明，在磷酸盐浓度为0.5%的条件下，与其他浓度条件下的酶活差异极显著（P<0.01），因此，确定磷酸盐0.5%的浓度作为优化结果。

2.3.5 响应面试验结果 选择碳源（麸皮）浓度、氮源（蛋白胨）浓度和磷酸盐（KH2PO3）浓度作为培养基组分优化因子（分别为X1、X2、X3）以FPA酶（Y1）和CMC酶（Y2）活力分别作为响应值设计试验方案。试验因子和水平见表1，试验方案和结果见表2。

使用mintab 16进行关于响应值与因子麸皮浓度（X1）、蛋白胨浓度（X2）和磷酸盐浓度（X3）的二次回归分析，去掉不显著因素，得到二次表达式：

Y1=29.81-X3-4.267 5X21-1.872 5X22-3.52X23-1.352 5X2X3;

Y2=134.14+2.355X1-1.383 8X3-6.913 7X21-3.091 2X22-5.166 3X23-1.837 5X2X3。

方程显著性检验结果如表3至表6所示，2个回归方程都具有显著性（R21=0.936，R22=0.949，P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），剔除其他项后，保留的各项系数都具有显著性（P<0.05）。根据显著性检验结果可以得知，对于菌株产FPA酶活力来说，培养基中的麸皮浓度和蛋白胨浓度在二次水平上影响FPA酶的产生，磷酸盐浓度在一次水平和二次水平上都对FPA酶的产生具有显著性影响，麸皮浓度和蛋白浓度之间及麸皮与磷酸盐浓度之间不具有交互作用，而蛋白胨和磷酸盐之间对FPA酶的产生具有交互作用。对菌株所产CMC酶来说，麸皮浓度在一次水平上也会影响CMC酶活的生产，其他与FPA酶一致，由此说明，菌株所产的CMC酶活力是FPA酶活力的重要组成部分。

利用mintab 16软件绘出等值线图及响应面图（图9、图10）。等值线的形状反映因素间交互作用的大小，图形倾斜表示交互作用显著。结合方差分析和响应面图可知，蛋白质浓度与磷酸盐浓度交互作用具有显著水平，而麸皮与蛋白胨、麸皮与磷酸盐之间的交互作用不显著。

FPA酶优化后水平为：X1=0，X2=0.055 1，X3=-0.152 6;CMC酶优化后因子水平为：X1=0.170 3，X2=0.037 8，X3=0.141 4。考虑2种酶取因子水平平均值：X1=0.085 15，X2=0.046 45，X3=-0.005 6。对应的麸皮浓度为2.54%，蛋白胨为0.92%，磷酸盐为0.497%（取0.50%）。在此条件下利用回归表达式预测2种酶活力大小，FPA酶为29.78 IU/mL，CMC酶为134.29 U/mL。

2.4 优化结果验证

根据优化结果，在麸皮浓度2.54%、蛋白胨浓度0.92%、磷酸盐浓度0.50%、发酵初始pH值 5.5、接种量4%和发酵时间36 h的条件下对菌株进行5次产酶试验，检测产酶活力，并与模型预测值比较，结果如表7所示。

验证试验显示，在菌株所产纤维素酶活力与模型预测值接近，差率很小（<5%），由此可确定对菌株DM-4产酶条件的优化模型是有效和可靠的。

3 结论

利用单因素试验和响应面试验，确定产纤维酶菌株DM-4的产酶优化条件为：发酵时间为36 h，接种量4%，培养基初始pH值5.5～6.0，培养基麸皮浓度2.54%，蛋白胨浓度0.92%，磷酸盐浓度 0.5%。验证试验表明优化模型是有效和可靠的。

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