Cr6+、Pb2+和Ni2+对莱茵衣藻的毒性效应研究

魏思洁，马馨月，张 超，柯 檀，张渝蕊，陈兰洲

(武汉大学资源与环境科学学院，湖北 武汉 430079)

随着我国工业化的快速发展，大量污染物被释放后进入水体，在污染水环境的同时，也对人类健康和生存造成严重的影响[1]。为了控制废水污染物对水环境造成的危害，我国规定了废水中污染物的理化指标，如化学需氧量(COD)、总氮(TN)、总磷(TP)等的标准限值[2]。但即使废水中污染物的理化指标达标，废水中污染物仍会对水生生物产生一系列毒性效应，最终可能会威胁水生态系统的平衡[2]。因此，除了根据污染物理化指标来评价废水排放对水环境的危害外，还应针对废水中污染物对水生生物的综合毒性效应进行检测，以达到对水环境进行综合评价的目的。

我国水体重金属污染问题十分突出[3]，江河湖库底质的重金属污染率相当高，并且随河流携带入海的重金属污染物总量巨大，这些重金属污染物可能会对整个水生态系统造成负面影响[4]。藻类作为水体中的初级生产者在水生态系统中具有十分重要的作用，同时藻类由于个体小、繁殖快、易于培养且对污染物敏感，被广泛应用于废水监测[5]。重金属污染物如Cr6+、Pb2+和Ni2+进入水体后，可对藻细胞产生生长抑制、生理代谢混乱等毒性效应[6]。莱茵衣藻作为模式生物与许多高等动植物在某些基因和生理机制上具有同源性，利用莱茵衣藻开展重金属的水环境生物效应研究具有重要的意义[7]。因此，本研究以莱茵衣藻为受试生物，利用快速叶绿素荧光诱导动力学分析和毒理测试方法，开展3种典型重金属(Cr6+、Pb2+和Ni2+)对莱茵衣藻的单一毒性效应试验，分析莱茵衣藻的光合活性和抗氧化系统对不同种类和不同浓度重金属毒性效应的响应情况，以为莱茵衣藻作为指示生物应用于重金属污染水体监测提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻种来自于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻类藻种库(FACHB)。无菌操作下将藻种转接至新鲜灭菌过的SE(Selenite Enrichment)培养基中，于光照培养箱中以恒温20℃±1℃、光强50 μE/(m2·s)、12 h∶12 h明暗交替光照周期条件下，通气培养至生长对数期。

1.2 试验方法

1.2.1 重金属处理莱茵衣藻的方法

取100 mL SE培养基置于若干个锥形瓶中，向锥形瓶中分别加入不同体积的K2Cr2O7母液(1 g/L)，使Cr6+的最终浓度分别为0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L；另在锥形瓶中分别加入不同体积的Pb(NO3)2母液(1 g/L)，使Pb2+的最终浓度分别为0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L；另在锥形瓶中分别加入不同体积的Ni(NO3)2母液(5 g/L)，使Ni2+的最终浓度分别为0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L。将含有重金属污染物的培养基经高压灭菌，备用。取100 mL培养至生长对数期的莱茵衣藻，离心收集藻体，再经无菌操作转移至上述含不同浓度重金属污染物的培养基中，混匀后置于光照培养箱中培养，经不同的处理时间后取样测定藻液的参数，每组样品设置3个平行样。

1.2.2 叶绿素荧光参数的测定方法

取2 mL经重金属处理后的藻液，避光放置15 min后，采用便携式植物效率分析仪(PEA，Hanasatech®，U.K.)于室温、遮光条件下测定莱茵衣藻叶绿素荧光参数，激发光强为最大光强的50%[约为1 500 μE/(m2·s)]，记录时间为5 s。利用测得的叶绿素荧光参数，经过处理后可绘制叶绿素荧光诱导动力学曲线，并可计算得到其他关于莱茵衣藻光系统Ⅱ(PSⅡ)的光合参数，包括最大光化学量子产量(Fv/Fm)、单位面积内反应中心数量(RC/CS0)、照光2 ms时有活性的反应中心的开放程度(ET0/TR0)和反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额(ET0/ABS)[8]。

1.2.3 叶绿素a含量的测定方法

藻液中叶绿素a含量的测定采用乙醇-分光光度法[8]。取5 mL经重金属处理后的藻液，离心(8 000 r/min，10 min，4℃)后弃去上清液，收集藻体；然后加入5 mL 95%乙醇，摇匀置于4℃冰箱24 h后，再次离心(8 000 r/min，10 min，4℃)，取上清液测定665 nm和649 nm处的吸光度值，并通过以下公式计算得到藻液中叶绿素a含量：

叶绿素a含量=13.95×OD665-6.88×OD649

(1)

式中：叶绿素a含量为藻液中叶绿素a含量(mg/L)；OD665和OD649分别为665 nm和649 nm处的吸光度值。

1.2.4 藻类丙二醛(MDA)含量的测定方法

取5 mL经重金属处理后的藻液，离心(8 000 r/min，10 min，4℃)后收集藻体，用磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.8)洗涤3次；然后加入5 mL磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.8)，冰浴超声破碎后离心(8 000 r/min，10 min，4℃)，得到的上清液即为粗酶提取液。

藻类丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法[9]。取1 mL粗酶提取液，加入2 mL 10%三氯乙酸、2 mL 0.6%硫代巴比妥酸，混合均匀后置于100℃水浴20 min；然后冷却至室温后，测定其在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值，并通过以下公式计算藻液中MDA含量(最终结果以单位叶绿素a的MDA含量表示)：

MDA=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

式中:MDA为藻液中MDA含量(mmol/mg)；OD532、OD600和OD450分别为532 nm、600 nm和450 nm处的吸光度值。

1.2.5 可溶性蛋白质含量的测定方法

藻液中可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[9]。取0.1 g考马斯亮蓝(G-250)溶于50 mL 95%乙醇中，混匀后加入100 mL 85%浓磷酸，用蒸馏水定容至1 000 mL；然后取1 mL粗酶提取液加入5 mL G-250试剂并混匀，5 min后测定其在595 nm处的吸光度值，再根据可溶性蛋白质吸光度的标准曲线计算藻液中可溶性蛋白质含量。本次试验使用结晶牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定方法

藻液中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑法[9]。向样品管中加入1 mL粗酶提取液，向对照管中加入1 mL磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.8)；然后分别加入3.1 mL磷酸缓冲液(50 mmol/L，含100 μmol/L EDTA-Na2)、0.3 mL甲硫氨酸溶液(220 mmol/L)、0.3 mL氯化硝基四氮唑蓝溶液(1.25 mmol/L)和0.3 mL核黄素溶液(33 μmol/L)，混匀后，取其中一组对照管于避光条件下反应，另一组对照管和样品管于4 000 Lux日光灯下反应，20 min后测定对照管和样品管中反应液在560 nm处的吸光度值，通过以下公式计算酶活：

SOD=2×(ODCK-OD560)/ODCK

(3)

式中:SOD为超氧化物歧化酶活性(U/mg)；ODCK和OD560分别为对照管和样品管中反应液在560 nm处的吸光度值。

1.2.7 重金属对莱茵衣藻的毒性效应评价方法

藻液经重金属处理72 h后，以重金属浓度的对数值(lgC)为横坐标，以重金属对莱茵衣藻的3项毒性评价指标(Fv/Fm、MDA含量、SOD活性)的相对抑制率为纵坐标，分别对数据进行线性拟合，再根据各个毒性评价指标的线性拟合优度(R2)和半数效应浓度(EC50)值为标准，选取最敏感的毒性评价指标进行后续评价。毒性评价指标的相对抑制率计算公式如下：

相对抑制率(%)=(S0-Sm)/S0×100%

(4)

式中:S0为对照组的毒性评价指标数值，Sm为样品组的毒性评价指标数值。

1.2.8 数据分析方法

本文利用Origin软件中的线性拟合功能得到毒性评价指标相对抑制率对重金属浓度对数值的拟合直线及相关拟合参数，再利用SPSS软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncant法进行3项毒性评价指标的差异性分析(p<0.05)。

2 试验结果与分析

2.1 重金属胁迫对莱茵衣藻叶绿素荧光诱导动力学曲线的影响

不同重金属浓度和不同时间处理条件下莱茵衣藻叶绿素a荧光诱导动力学曲线的对比，见图1。O相、J相、I相和P相荧光值分别为暴露时间50 μs、2 ms、30 ms和叶绿素a荧光诱导动力学曲线最高峰处的荧光强度[10]。

由图1可见，经重金属处理24 h后，莱茵衣藻叶绿素a荧光强度随重金属浓度的增加逐渐下降，此时J相、P相荧光值虽然强度减弱但仍可被观察到；经重金属处理72 h后，在部分高浓度重金属胁迫下P相荧光值随着处理时间的增加，其强度越来越弱，莱茵衣藻叶绿素a荧光诱导动力学曲线几乎为平直状态；在整个处理过程中，Cr6+和Pb2+处理组叶绿素a荧光强度比Ni2+处理组下降得更迅速且下降幅度更大。

2.2 重金属胁迫对莱茵衣藻光合参数的影响

不同重金属浓度和不同时间处理条件下莱茵衣藻光合参数变化的对比，见表1和图2。

由表1和图2可知，在加入重金属后，随着时间的推移和重金属浓度的增加，莱茵衣藻的光合参数Fv/Fm、RC/CS0、ET0/TR0和ET0/ABS显著下降且下降幅度越来越大，高浓度重金属处理组的部分光合参数值接近于0，表明高浓度重金属明显抑制了莱茵衣藻的光合参数，但随着Ni2+浓度的增加，莱茵衣藻的光合参数ET0/TR0和ET0/ABS的变化并不显著。

2.3 重金属胁迫对莱茵衣藻MDA含量的影响

不同浓度重金属和不同时间处理条件下莱茵衣藻MDA含量变化的对比，见图3。

图1 不同重金属浓度和不同时间处理条件下莱茵衣藻叶绿素a荧光诱导动力学曲线的对比Fig.1 Comparison of chlorophyll fluorescence induction kinetics curves of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period注：CK代表无重金属胁迫的对照组。下同。

表1 不同重金属浓度和不同时间处理条件下莱茵衣藻光合参数变化的对比Table 1 Comparison of photosynthetic parameter changes of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time periods

续表1

光合参数处理时间/d不同浓度Pb2+处理0(CK)2mg/L4mg/L6mg/L8mg/L10mg/L10.343±0.003a0.337±0.002b0.335±0.002b0.302±0.003c0.275±0.002d0.233±0.002eET0/TR020.321±0.003a0.315±0.003b0.216±0.002c0.220±0.002c0.197±0.002d0.158±0.002e30.321±0.002a0.222±0.002b0.193±0.002c0.118±0.002d0.056±0.002e0.000±0.001f1329.66±35.59a325.56±26.67a302.12±30.34ab294.24±28.97ab283.24±28.28ab264.06±28.97bRC/CS02325.42±25.28a275.33±10.19b211.45±9.55c155.98±7.49d103.58±11.87e80.98±3.13e3307.21±29.99a164.62±12.83b123.59±15.97c92.83±7.17d65.88±5.41de39.62±6.76e光合参数处理时间/d不同浓度Ni2+处理0(CK)5mg/L10mg/L15mg/L20mg/L25mg/L10.264±0.0340.261±0.0280.260±0.0190.261±0.0220.249±0.0140.252±0.014ET0/ABS20.256±0.0480.256±0.0350.258±0.0350.262±0.0250.251±0.0260.257±0.02230.258±0.0270.248±0.0250.247±0.0240.232±0.0220.226±0.0100.221±0.01410.367±0.0360.368±0.0320.368±0.0340.367±0.0320.361±0.0330.362±0.028ET0/TR020.361±0.0390.360±0.0380.366±0.0380.372±0.0310.367±0.0400.369±0.03230.357±0.0390.354±0.0400.353±0.0310.323±0.0340.347±0.0310.359±0.0321552.16±36.07a534.85±21.51a503.75±39.16ab494.80±38.08ab487.86±40.14ab453.99±44.30bRC/CS02549.48±26.80a482.15±10.14b428.30±44.40bc394.78±29.30cd356.35±36.61d399.40±48.91cd3549.74±41.36a352.92±11.51b300.23±24.94c268.69±41.95c149.33±15.97d147.79±11.87d

注：a、b、c、d、e、f表示使用单因素方差分析中的Duncant法得出的不同数据之间差异的显著性(p<0.05)。下同。

图2 不同浓度重金属和不同时间处理条件下莱茵衣藻PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化的对比Fig.2 Comparison of changes of maximum quantum yield of PS II photochemistry (Fv/Fm) of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period

图3 不同浓度重金属和不同时间处理条件下莱茵衣藻MDA含量变化的对比Fig.3 Comparison of changes of MDA content of C.reinhardtii processed by different concentration of heavy metals in various time period

MDA是由膜脂过氧化产生的，其含量的高低反映了细胞膜被氧化的程度，也在一定程度上反映了细胞内活性氧(ROS)的水平[11]。由图3可见，经Pb2+和Ni2+处理2 d后，莱茵衣藻中MDA含量增加并不明显，甚至有部分处理组莱茵衣藻中MDA含量下降，但Cr6+胁迫下莱茵衣藻中MDA含量显著增加；经不同重金属处理3 d后，莱茵衣藻中MDA含量均上升，其中Ni2+处理组莱茵衣藻中MDA含量上升不明显，而Cr6+和Pb2+处理组上升显著且呈梯度上升。

2.4 重金属胁迫对莱茵衣藻SOD活性的影响

不同浓度重金属和不同时间处理条件下莱茵衣藻SOD活性变化的对比，见图4。

SOD是一种清除生物体内产生的超氧阴离子自由基的酶，它能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减少自由基对生物体的损害[12]。由图4可见，经Cr6+和Pb2+处理1 d后，部分处理组莱茵衣藻中SOD活性增强，但Ni2+处理组SOD活性一直降低；经不同重金属处理3 d后，莱茵衣藻中SOD活性均显著降低，且重金属浓度越大，莱茵衣藻中SOD活性降低速度越快。

图4 不同浓度重金属和不同时间处理条件下莱茵衣藻SOD活性变化的对比Fig.4 Comparison of changes of SOD activity of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period

2.5 重金属胁迫对莱茵衣藻的毒性效应评价

不同重金属对莱茵衣藻3项毒性评价指标的相对抑制率与重金属浓度的线性拟合优度对比，见图5。

图5 不同重金属胁迫下莱茵衣藻3项毒性评价指标的相对抑制率与重金属浓度的线性拟合优度对比Fig.5 Comparison of linear goodness of fit of relative inhibition rates among three toxicity evaluation indexes of heavy metals to C.reinhardtii with heavy metal concentrations注：lgC为重金属浓度的对数值

由图5可见，不同重金属对莱茵衣藻3项毒性评价指标的相对抑制率与重金属浓度的线性拟合优度R2值排序均为Fv/Fm>SOD活性>MDA含量，即莱茵衣藻光合参数Fv/Fm的拟合优度最佳。

通过比较不同重金属胁迫下莱茵衣藻3项毒性指标的EC50值(见表2)可知：各重金属对莱茵衣藻毒性评价指标中Fv/Fm的EC50值最小，结合图5结果可知，3项毒性评价指标中，Fv/Fm对重金属的毒性响应最为敏感，表明莱茵衣藻光合参数Fv/Fm是表征重金属对莱茵衣藻毒性效应的最佳参数。

表2 不同重金属胁迫下莱茵衣藻3项毒性评价指标的EC50值Table 2 EC50 values of three toxicity evaluation indexes of C.reinhardtii under the stress of different heavy metals

重金属对莱茵衣藻毒性评价指标的相对抑制率达到50%时所需的重金属浓度越低，说明该重金属对莱茵衣藻的毒性效应越强。由表2可知，3种重金属对莱茵衣藻的毒性效应强度排序为Cr6+>Pb2+>Ni2+，表明莱茵衣藻对3种重金属的毒性效应响应程度存在一定的差异。

3 讨论与分析

当藻细胞受到外界污染物刺激时，会产生大量的ROS，若未被及时清除就会引起脂质过氧化、酶失活等损伤，导致藻细胞活性降低[18]。部分Pb2+和Ni2+处理组莱茵衣藻中MDA含量在24 h内有所降低(见图3)，可能是因为内源性抗氧化防御系统可以清除或修复受损的生物分子，SOD成功地清除了ROS，减少了MDA的生成，从而保持了细胞膜功能和结构的完整性[19]。Cr6+和Pb2+处理组24 h后莱茵衣藻中SOD活性有所上升(见图4)，可能原因是藻细胞在短期内迅速做出反应，启动保护机制，SOD合成增加以保持自由基平衡[20]；但Cr6+处理组莱茵衣藻中MDA含量没有降低，可能是由于莱茵衣藻对Cr6+的毒害最敏感，产生的MDA含量远大于MDA被清除的含量。随着处理时间的增加，重金属处理3 d后莱茵衣藻中SOD活性显著降低，且重金属浓度越大，其SOD活性降低速度越快，可能是由于藻细胞的保护机制仍无法完全消除ROS，导致藻细胞受到ROS的损伤随着时间的推移加剧，使得DNA本身或其转录过程受到影响，且SOD结构被破坏后补充量不足，导致后期莱茵衣藻中SOD活性降低。3种重金属处理72 h后，莱茵衣藻中MDA含量增加和SOD活性降低，说明3种重金属最终都会对莱茵衣藻造成一定的氧化损伤，但莱茵衣藻对Ni2+有一定的耐受性，而对Cr6+比较敏感，故在短期内Cr6+就对莱茵衣藻造成了较强的氧化损伤。

Fv/Fm参数可由快速叶绿素a荧光诱导动力学分析方法直接测得，不需要经过数据的输出和计算过程，因此适合作为4种光合参数的代表。同时，快速叶绿素a荧光诱导动力学分析作为毒性评价的探针，具有操作简便、快速有效且携带方便等优点，在污染物的环境监测中具有重要意义[21]。根据试验结果(见图5和表2)，选取Fv/Fm参数作为后续评价重金属对莱茵衣藻毒性效应的指标。根据不同重金属胁迫下莱茵衣藻的光合参数Fv/Fm的EC50值，得到不同重金属对莱茵衣藻的毒性强度排序为：Cr6+>Pb2+>Ni2+。Cr6+对莱茵衣藻的毒性效应最强，其原因可能是因为Cr6+具有强氧化性，可迅速对藻细胞的光合系统和DNA造成损伤[22]，并且莱茵衣藻的自身结构可能对Cr6+的胁迫更加敏感。

4 结论与展望

以莱茵衣藻为受试生物，利用快速叶绿素荧光诱导动力学分析和毒理测试方法，开展3种典型重金属(Cr6+、Pb2+和Ni2+)对莱茵衣藻的单一毒性效应试验，分析不同种类和不同浓度重金属对莱茵衣藻的光合性和抗氧化系统的影响，得到如下结论：

(1) 重金属Cr6+、Pb2+和Ni2+对莱茵衣藻的单一胁迫作用均能对其生理过程产生一定的毒害影响：3种重金属均可降低藻细胞的光合活性，增加膜脂质过氧化程度，抑制抗氧化酶活性，进而破坏藻细胞的整体稳态，影响其正常生长。

(2) 莱茵衣藻对不同种类和不同浓度的重金属毒性效应响应程度不同，三种重金属对莱茵衣藻的毒性效应大小排序为：Cr6+>Pb2+>Ni2+，即莱茵衣藻对Cr6+胁迫最敏感。另外，在3种重金属对莱茵衣藻的单一毒性效应试验中，毒性评价指标Fv/Fm对重金属毒性效应的响应最为敏感，说明利用快速叶绿素荧光诱导动力学分析能够快速、高效地检测出不同重金属对藻类毒性效应的强度。

本文研究结果表明，莱茵衣藻和快速叶绿素荧光诱导动力学分析在重金属污染废水监测中有较大的应用价值。但在实际废水环境中，重金属通常以共存的形式出现，并且其相互作用会对生物体造成不同的未知生理效应。因此，下一步的研究工作还需考察废水中共存重金属对莱茵衣藻的胁迫作用，以使莱茵衣藻在重金属废水监测中发挥更大的实际应用价值。