免疫组织化学染色中不同返蓝液效果评价

王晓星，易慕华，方捷迪，李争艳，曹春雨

免疫组化是通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，利用带显色剂标记的特异性抗体(或抗原)对组织细胞内相应的抗原(或抗体)进行定性、定位、定量检测的一项技术[1-2]，是病理科最常用的确诊疾病和诊断疑难病例的一种辅助检测手段[3-4]。免疫组化操作步骤包括抗原修复、抗体孵育、DAB显色、苏木精复染、分化、返蓝等[5-7]，每一步都会影响切片的评片等级(如优秀、良好、合格及不合格)，良好及以上的评片标准中不仅要求抗原定位准确、阳性着色与背景对比显著，还要求苏木精复染适度。我科参加湖北省病理科医疗质量控制中心举办的全省免疫组化室间测评活动成绩合格，专家组发现本科的免疫组化虽染色强度不错，但复染效果差。我科针对这一问题，及时邀请专家现场指导，苏木精染色在酸性条件下呈棕色，在碱性条件下呈蓝色，苏木精过染深分化后的返蓝尤为重要，同时将碱性抗原修复液EDTA用于细胞核返蓝，可重复性高，适用范围广，故迫切将EDTA的新用途向病理同仁进行汇报。本实验将病理科常用的几种返蓝液用于细胞核的蓝化，了解不同返蓝液的返蓝效果，重点评价非常规使用的EDTA作为返蓝液对阴性细胞核返蓝后的颜色和稳定性，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料随机选取三峡大学第二临床医学院2017年1～12月存档的石蜡标本20例，复习完整的临床资料，所有患者术前均未行放、化疗等其他治疗，标本前期处理一致，均经规范化取材、10%中性福尔马林固定、常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋及制片。每个标本按免疫组化染色要求连续切6张切片，分为6组，每组20张(即20例)。

1.2 仪器与试剂隔水式电热恒温培养箱(HENGZI，上海跃进公司)。即用型鼠抗人Ki-67核抗原单克隆抗体(Catalog#0077)购自DAKO公司，显色系统购自DAKO公司。碳酸锂粉末(BASO公司)、浓氨水(西陇化工公司)及EDTA液体试剂(DAKO公司)经购买后在实验室或科内按要求自行配制。饱和碳酸锂溶液：碳酸锂粉末溶解于1 000 mL蒸馏水中，pH约9.0；0.3%氨水：将3 mL浓氨水溶解于1 000 mL蒸馏水中，pH约9.0；EDTA溶液：将EDTA原液用蒸馏水稀释50倍待用，室温下EDTA溶液pH约8.0，50 ℃时pH约8.5。

1.3 方法免疫组化染色采用EnVision两步法：3 μm厚连续切片，依次将石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，EDTA(pH 9.0)对组织抗原进行高压修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗Ki-67，37 ℃孵育60 min；取出切片，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；DAB显色10 min，苏木精复染6 min、分化20 s、返蓝2 min、脱水、透明和封固。返蓝试剂分别为饱和碳酸锂(pH 9.0)、0.3%氨水(pH 9.0)、室温EDTA(pH 8.0)、加热EDTA(pH 8.5)、流动自来水(pH 7.0)及温水(pH 7.2)，以上返蓝试剂室温为(15±2) ℃，加热温度为(50±2) ℃。

1.4 结果判定Ki-67阳性信号位于细胞核，优质的免疫组化切片标准是复染适宜，染色清晰，着色恰当，阴性与阳性部位蓝棕相映，对比分明，透明度高。

2 结果

基于组织前处理及免疫组化染色方法相对一致前提下，苏木精复染后最佳返蓝液是以得到最适阴性细胞核蓝染及最佳阳性和阴性棕蓝对比为标准。本实验分别选取饱和碳酸锂、0.3%氨水、加热EDTA(约50 ℃)、室温EDTA、温水、流动自来水共6种溶液作为返蓝液，同批次染色分别作用于标本来源相同的免疫组化切片，即该实验仅返蓝液不同，其它条件完全相同，本实验中20例切片在不同返蓝液作用下均可返蓝，现以其中1例乳腺癌标本进行详细阐述。

免疫组化切片返蓝效果显示6种返蓝液均具有返蓝作用，但返蓝结果不一致，其中流动自来水(图1A)处理后，胞核呈蓝黑色，组织切片对比度及透明度均差，间接影响免疫组化的结果判读；而经加热EDTA(约50 ℃)返蓝后(图1B)切片复染适合，着色适度，透明度好，阴性部位与阳性部位蓝棕相映，对比鲜明，但部分区域阴性核较灰暗；切片经室温EDTA(图1C)或温水(图1D)处理后，阴性细胞核显蓝紫色；而饱和碳酸锂(图1E)及0.3%氨水(图1F)返蓝后，细胞核呈紫色。结果表明，加热EDTA(约50 ℃)、室温EDTA与其它四种返蓝液效果相仿，作为抗原修复液的EDTA获得新的应用，可考虑作为返蓝液。

图1 使用不同返蓝液返蓝显示乳腺癌中Ki-67的表达，EnVision两步法：A.流动自来水(pH 7.0)；B.加热EDTA(约50 ℃，pH 8.5)；C.室温EDTA(pH 8.0)；D.温水(pH 7.2)；E.饱和碳酸锂(pH 9.0)；F.0.3%氨水(pH 9.0)

3 讨论

本实验通过查阅资料并结合国内病理科技术发展现状，选择病理科普遍使用的6种返蓝液，即饱和碳酸锂[8]、0.3%氨水[9]、EDTA(室温)、EDTA(50 ℃)、流动自来水及温水(50 ℃)，以上试剂具有经济实惠、方便实用、使用广泛和高效性。以湖北省为例，流动自来水不同县市的水质及pH存在显著差异，当该地区流动自来水质偏酸性则会使细胞核经苏木精复染再返蓝后细胞核偏红或棕，返蓝效果不佳，直接影响免疫组化切片的染色效果与切片优良率，为达到优良评价等级，技术员常通过调节流动自来水的温度或冲洗时间来达到最佳返蓝效果，但有时会出现制片时间过长或因不同技术员间出现个体差异。本实验以其中1例乳腺癌标本进行实验，结果显示6种返蓝试剂均具有返蓝作用，加热EDTA(约50 ℃)或室温EDTA与饱和碳酸锂、0.3%氨水、流动自来水及温水(50 ℃)效果相当，可考虑将抗原修复液EDTA用作返蓝液。

EDTA可作为返蓝液的原因：(1)EDTA是碱性试剂，EDTA的返蓝原理和其他返蓝液一样，均是使苏木精复染后的细胞核在碱性条件下呈现蓝色。(2)溶液温度对pH存在一定的影响，通常温度升高，溶液电解质电离越强，电离出更多的氢氧根离子，溶液的pH升高。实验中室温EDTA的pH约8.0，加热EDTA的pH 8.5，流动自来水pH 7.0，温水pH 7.2，加热后的返蓝液pH变大，这一结果与温度的改变引起溶液pH改变理论相一致。(3)与其它pH不同的返蓝试剂相比，pH为8.0～8.5的环境下也适合细胞核的蓝化。(4)作为组织修复的EDTA试剂中含有脱蜡剂，增加切片的透明度，促使细胞核的蓝色更鲜艳。所以，EDTA不仅可用于免疫组化中的组织抗原修复，还可以再加热作为后续的返蓝试剂用于临床及科研中对细胞核的蓝化，保证返蓝液的新鲜与酸碱度，在节约成本的同时，使免疫组化切片染色达到免疫组化室间质量控制标准，但其返蓝的缺陷暂未发现。