山东省番茄溃疡病病原菌的分离与鉴定

苏晓梅　刘淑梅　李嘉琦　王施慧　侯丽霞

摘要：本试验对山东省内不同地区番茄溃疡病发病情况进行调查，采集具有典型症状的病样，采用组织分离方法分离纯化病原菌，并对其进行形态学观察、分子生物学鉴定和致病性测定。结果表明，不同地区番茄病样分离得到的4个菌株均属于溃疡病菌Cmm，但致病力存在差异。本研究可为番茄溃疡病的准确鉴定和病害防治提供参考。

关键词：番茄溃疡病;Cmm;病原菌;分离鉴定

中图分类号：S436.412.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）05-0100-05

Abstract In this experiment， the incidence of tomato bacterial canker disease was investigated in different areas of Shandong Province. The diseased samples with classical symptom were collected， and then the pathogen was isolated by tissue-isolation method and the morphological characteristics， molecular identification and pathogenicity test were conducted. The results showed that four strains were obtained from the investigated areas in Shandong Province. All they belonged to Cmm with different pathogenicity. This research could provide references for the identification and control of tomato bacterial canker.

Keywords Bacterial canker of tomato;Cmm;Pathogen;Isolation and identification

番茄溃疡病（bacterial canker of tomato）是一种由细菌侵染而引起的维管束病害，病原菌为密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm），可侵染辣椒、龙葵、裂叶茄及其它番茄属植物。番茄溃疡病的主要症状包括叶片边缘坏死、叶片萎蔫至枯死;茎和叶柄出现褐色条斑，病斑下陷、开裂而露出髓腔，呈溃疡状以及维管束变褐等;果实出现圆形病斑，中央浅褐色、边缘为白色晕圈，形似鸟眼状，可联合成不规则斑块[1]。该病害在番茄生育期内均可发生，特别是温暖潮湿条件更易造成该病的大规模暴发与流行。我国于1985年首次在北京市平谷发现番茄溃疡病[2]。1993年东北地区也报道了该病发生[3]。2002年，安徽省国宁市方塘乡番茄溃疡病发病率超过80%。2007—2009年，该病给贵州省修文县造成的产量损失达40%～50%[4]。近年来，随着气候的异常变化及番茄种植规模扩大，番茄溃疡病在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、河北、河南、山东、上海、海南、重庆、湖北、贵州等省区均有不同程度发生，且逐年加重，这对番茄生产造成一定影响[1，5-8]。

本研究对山东省不同地区番茄溃疡病田间发病情况进行调查，采集病样进行病原菌分离与纯化，并对分离得到的病原菌进行形态学观察、分子生物学鉴定以及致病性测定，以明确不同地区番茄溃疡病菌的致病力差异，为番茄溃疡病的鉴定、防治及探索该病病原菌的多态性提供參考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试培养基： 523液体培养基：每升含10 g蔗糖、8 g水解酪素、4 g酵母浸膏、2 g K2HPO4、0.3 g MgSO4·7H2O。523固体培养基：在上述523液体培养基基础上添加15 g琼脂。培养基用前高压灭菌，且pH值调整为6.9～7.1。

病原菌致病性测定试验所用番茄品种Heinz 1706，种植于32孔穴盘，待长至三叶一心时进行处理。

1.2 田间调查及病样采集

于2018—2019年调查山东省泰安市岱岳区、济南市济阳区、蒙阴县、寿光市等地番茄溃疡病发病情况，选择典型病株，观察、记录病害症状，并将病样带回实验室进行病原菌分离。

1.3 病原菌分离培养及形态观察

采用常规组织分离法对病原菌进行分离。具体步骤：使用灭菌解剖刀切取病健交界处1～2 cm茎段，先用无菌水冲洗干净，再经1% NaClO 溶液消毒5 min，后用无菌水清洗3次;将消毒后茎段置于灭菌培养皿中，加1～2滴无菌水，挤压使组织液渗出;用灭菌接种环蘸取组织液在523固体培养基平板上划线：先在平板的一侧顺序划3～5条线，再将培养皿转60°，从第二条线末端顺序划3～5条线[9]。后置于 28℃恒温箱中培养2～3 d后，挑取疑似溃疡病菌落进行纯化培养，观察、记录菌落形状、大小、颜色等形态特征。

1.4 病原菌分子生物学鉴定

挑取纯化后菌落至523液体培养基中，28℃、200 r/min振荡培养12 h后，6 000 r/min离心2 min，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于无菌水中备用。

以上述重悬菌体为模板，采用表1中引物进行PCR扩增。反应体系（10 μL）：菌悬液 2 μL，上、下游引物各0.25 μL，2×Taq Mix 5 μL，ddH2O 2.5 μL。反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环;72℃延伸5 min，16℃保存。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京六合华大基因科技有限公司测序。利用NCBI数据库的Blast程序对测序结果进行比较。

1.5 病原菌致病性測定

将纯化后各病原菌分别转至523液体培养基中，28℃、200 r/min 振荡培养12 h后，将各菌悬液浓度调至108～109 cfu/mL。采用打顶法接种，将手术剪前端1 cm处蘸取菌悬液，在幼苗新叶处将主茎剪断[14]，以蘸取无菌水为对照，每份菌悬液接种8株，重复3次。接种后，先将植株置于28℃环境中（RH为90%～100%）保湿48 h，再进行正常管理（白天25～28℃、夜晚20～22℃，平均湿度80%～90%），20 d后观察病情发展情况。

2 结果与分析

2.1 山东省不同地区番茄溃疡病的田间发病情况

经调查发现，不同地区番茄病株表现症状一致，均为下部叶片先出现染病症状，后逐渐向顶端蔓延。该病进一步扩展时，叶柄、侧枝或主茎出现灰褐色条斑，后期茎部略变粗、表面产生许多不定根或刺状突起、开裂，髓部中空变褐，全株枯死;果实出现典型的“鸟眼斑”症状，即病斑中央产生黑色小斑点并伴有白色晕圈，多个病斑融合使果实表面粗糙（图1）。

2.2 病原菌分离与形态学鉴定

本试验从不同地区番茄病样中分离得到4株菌株。培养3 d后，各菌株形态基本相同：菌落呈凸圆形，黄色，表面平滑，边缘无锯齿，粘稠状，直径为1～3 mm（图2）。根据形态学特征，初步鉴定4个菌株均为番茄溃疡病菌Cmm。

2.3 病原菌分子生物学鉴定

由图3可以看出，不同引物均能扩增出特异条带，大小与预期一致，而对照无条带。将引物27F/1492R扩增得到的产物进行测序，经Blast比对，发现其与HQ144241.1（已知Cmm序列的GeneBank登录号）同源性达99%以上（图4）。因此，分离获得的病原菌为番茄溃疡病菌Cmm。

2.4 病原菌致病性鉴定

由图5可以看出，接种济阳、蒙阴、寿光分离菌株的番茄幼苗明显出现萎蔫、死亡症状。其中接种济阳分离菌株的幼苗症状最重，所有植株均死亡，接种蒙阴分离菌株的幼苗症状次之，接种寿光分离菌株的8株幼苗中有3株萎蔫死亡、5株萎蔫，而接种岱岳分离菌株的幼苗无明显发病症状，仅在接种伤口处出现萎蔫，个别叶片发生萎蔫。因此，不同地区的番茄溃疡病菌株致病力强弱存在差异。

3 讨论与结论

本试验采集山东省内主要番茄产区的番茄溃疡病样，并从中分离获得纯化菌株。根据形态学观察和分子生物学鉴定结果，证实所得菌株均为Cmm。这与其它地区所报道[5，7]的番茄溃疡病菌一致。然而，本研究样本仅采自山东省，存在一定局限性。但引起番茄溃疡病的病原菌并没有生理小种分化，只是致病力有所差异。这与前人的研究[15-17]基本一致。因此，下一步应扩大采集和鉴定国内番茄产区的溃疡病菌，对其遗传多样性及致病性差异进行分析。另外，番茄溃疡病菌Cmm的测序工作已经完成[18]，可充分利用基因组数据信息，在病原菌的致病机制和寄主的抗病机理及阐明二者互作机制方面开展研究，从而更好地为该病害防治提供参考。

近年来番茄溃疡病已成为我国番茄生产的重大威胁，许多国家已将其列为检疫性病害。目前，该病害主要以预防为主，生产中尚无有效防治药剂，而培育抗病品种是有效的防治手段。本研究对番茄溃疡病菌进行分离鉴定以及致病力测定，这是进行番茄溃疡病抗性鉴定的前提，下一步还需建立完善的苗期接种鉴定体系以及筛选鉴定番茄种质资源，更好地为番茄溃疡病的抗病育种及利用研究奠定基础。

参 考 文 献：

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