双水相法制备鳜鱼（Siniperca chuatsi）肌动蛋白及定量分析

王洋洋，徐明芳,*，白卫滨，郑春丽，叶 蕾，郑琴琴

（1.暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632；2.暨南大学理工学院，广东 广州 510632）

鳜鱼（Siniperca chuatsi）俗称翘嘴鳜、桂花鱼、桂鱼等，隶属鲈形目、鮨科，为我国特有的淡水肉食性凶猛鱼类，在中国分布极为广泛，除青藏高原外，南北水系中均有出产，广泛分布于中东部的江河、湖库中。鳜鱼肉质纯白细嫩、味道鲜美可口，是我国重要的名贵经济鱼类，深受广大消费者的喜爱，有“淡水石斑”之称[1]，是进行鱼类肌肉品质评价研究的良好材料。鱼肉主要由蛋白质和脂肪构成，鱼类肌肉蛋白质量分数高达18%～22%，高于猪肉（20.2%）、牛肉（19.8%）、羊肉（15.5%）等禽类的蛋白质含量[2]。鱼类肌肉中的肌原纤维蛋白约占总蛋白质的55%～60%，是鱼肌肉中含量最高的蛋白质[3]，适宜的加工处理可以使其形成稳定的网络结构，从而赋予肉制品良好的凝胶特性和感官特性[4]，主要包括起收缩作用的肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白等[5]，其中肌动蛋白和肌球蛋白的含量分别约占肌原纤维蛋白的20%和50%～55%[3]。肌浆蛋白占总蛋白质的25%～35%，主要包括肌白蛋白、球蛋白和酶类等多种蛋白质[6]；基质蛋白是结缔组织蛋白质，质量分数约为10%～15%[7]，包括胶原蛋白、网状蛋白及黏蛋白等；肌动蛋白是所有真核细胞中高度保守的丰富蛋白质[8-9]，单体肌动蛋白分子质量约为42 kDa，由375～377 个氨基酸组成。在肌肉细胞中，肌动蛋白细丝参与肌肉收缩。在非肌细胞中，肌动蛋白通过单体（G-肌动蛋白）和聚合体（F-肌动蛋白）形式之间的动态转换调节多种细胞过程，包括细胞分裂、黏附、运动和物质运输[10]。在肉制品中，肌动蛋白不能单独形成凝胶，但与肌球蛋白以一定比例结合可改变形成凝胶的能力，是影响肉糜及肉制品加工特性的主要特性蛋白质[11]。肌动蛋白的变性温度显著高于肌球蛋白，在肉制品冻藏过程中，肌动蛋白比肌球蛋白更稳定[12]。

目前，国内外对肌动蛋白提取研究主要包括王志峰等[13]的丙酮抽提-层析法、张秀真[14]的两次层析法及Ebashi[15]的离心直提法，这些方法实验步骤多耗时，操作繁琐溶剂消耗大。因此，建立一种高效快速分离肌动蛋白方法对于名贵鱼类品质鉴定及营养功能与加工特性研究十分必要。双水相萃取（aqueous two-phase system，ATPS）是一种新型的液-液萃取技术，对蛋白质、酶、病毒、核酸、抗体、抗生素等生物物质、天然产物的提取、纯化，具有处理时间短，条件温和，生物活性物质不失活、不变性，不存在有机溶剂残留，易于工艺放大和连续操作，提取率高等优点[16-18]，可以广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域。

肌动蛋白质量浓度测定方法主要包括化学法如考马斯亮蓝法、双缩脲法及光谱法等。Spudich[19]采用Lowry显色法测定兔骨骼肌肌动蛋白质量浓度，袁军等[20]应用双波长薄层扫描分析确定凝胶电泳样品中肌动蛋白占总蛋白质的相对百分含量，这些检测方法反应速度慢、易受干扰、定量结果偏差较大[21]。由于缺乏鱼类肌动蛋白标准品，仪器精确定量检测肌动蛋白的研究鲜有报道，导致名贵鱼类品质属性鉴定非常困难。毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）法是一类以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离-分析方法，分离效率高（理论塔板数已达106～107/m）、消耗的溶剂或样品体积小，可采用多种模式来改变选择性，扩大应用范围，操作简便，易于实现自动化等诸多优点[22]，广泛用于复杂蛋白质样品的多维分离与分析，以其快速高效的特点对于蛋白质的定量检测具有突出的优越性[23-25]。

本实验采用双水相体系分离肌原纤维蛋白中的肌动蛋白，通过高聚物-无机盐双水相体系与低分子有机物-无机盐双水相体系成相能力分析，建立双水相分离纯化鳜鱼肌动蛋白的方法，基于高效毛细管胶束电动色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）耦合二极管阵列检测器（diode array detector，DAD），探索MECC-DAD法定量检测鳜鱼肌动蛋白的新方法，以期为名贵鱼类质量品质属性的鉴定奠定基础，为肌动蛋白标准品的研制与大规模制备提供一种新的思路，为鱼类蛋白功能开发利用及快速定量检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6 尾龄鲜活鳜鱼购自暨南大学菜市场，养殖体质量（450±50）g，体长（25.2±0.5）cm，体高（8.1±0.5）cm，体质健康。每次取背部肌肉20 g于-20 ℃冰箱保存备用。

兔肌动蛋白（电泳纯≥85%）、对乙酰氨基酚（色谱纯≥99%） 上海源叶生物科技有限公司；异丙醇、硫酸铵 天津大茂试剂厂；预染蛋白Marker（10、15、25、35、40、55、70、100、130、170 kDa） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甲醇、无水乙醇、正丙醇、异丁醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（相对分子质量600、2 000、4 000、6 000、10 000）、四硼酸钠、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、无水碳酸钠、三水磷酸氢二钾（简称磷酸氢二钾）、考马斯亮蓝G-250等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Coulter P/ACETM MDQ型CE仪、毛细管柱（60 cm×75 μm，有效长度44 cm） 美国Beckman公司；CP224C型电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；UV1750型紫外分光光度计 日本岛津公司；HC-2518R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳仪器厂；Scientz-10N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂；DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYY-11型电脑三恒多用电泳仪 北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 双水相相图的制作

采用浊点法[26]绘制PEG-盐和有机溶剂-盐双水相体系的相图。

取一定量已知浓度的不同分子质量的PEG于25 mL的烧杯中；向其中逐滴加入已知浓度的盐溶液至混合溶液恰好出现浑浊，再滴加1 滴水，溶液马上变得澄清；再多加1 滴盐溶液，溶液又马上浑浊，则可以判定该浊点为临界点。重复上述操作，计算出浊点时溶液各组分的质量分数。

取一定质量的无机盐（m1）加入一定量的蒸馏水（m2）；然后逐滴加入有机溶剂（m3）至混合溶液恰好出现浑浊，再滴加1 滴水，溶液马上变得澄清；再多加1 滴有机溶剂，溶液又马上浑浊，则可以判定该浊点为临界点。重复上述操作，算出浊点时溶液各组分的质量分数。有机溶剂和无机盐质量分数计算如下：

1.3.2 肌原纤维蛋白提取

参考Lv Mingchun[27]等的方法稍作修改，取剁碎的鱼背部肌肉加入5 倍体积20 mmol/L Tris-马来酸（含0.1 mol/L NaCl，pH 7.5）缓冲液，搅拌均匀，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，沉淀重复3 次。将最后一次的沉淀溶于10 倍体积20 mmol/L Tris-马来酸（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.5）缓冲液，4 ℃静置1 h，10 000 r/min离心10 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液。将肌原纤维蛋白溶液用300 目尼龙网纱过滤，计算肌动蛋白提取率时，调节肌原纤维蛋白溶液的质量浓度为（1±0.05）mg/mL，4 ℃保存备用。

1.3.3 双水相分离肌动蛋白有机溶剂和无机盐的确定[28]

取1 mL肌原纤维蛋白溶液，向其中加入不同类型的短链醇有机溶剂和不同分子质量的PEG使之与磷酸氢二钾形成双水相。控制体系的总质量为10.0 g，相比为1.0左右，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）选出仅能分离出肌动蛋白单条带的有机溶剂，计算肌动蛋白的提取率确定最优有机溶剂。

取1 mL肌原纤维蛋白溶液，向其中加入不同类型的无机盐使之与异丙醇形成双水相。控制体系的总质量为10.0 g，相比为1.0左右，通过SDS-PAGE选出仅能分离出肌动蛋白单条带的无机盐，计算肌动蛋白的提取率确定最优无机盐。

式中：R为相比；Vt、Vb分别为上、下相体积/mL。

式中：c为上相肌动蛋白质量浓度/（mg/mL）；M为体系中肌原纤维蛋白的质量/mg。

1.3.4 单因素试验

以肌动蛋白提取率为评价指标，分别考察异丙醇质量分数（24%、26%、28%、30%、32%），硫酸铵质量分数（6%、8%、10%、12%、14%）、双水相体系pH值（6、7、8、9、10）及肌原纤维蛋白加入量（10%、20%、30%、40%、50%）对肌动蛋白提取率的影响。

1.3.5 响应面分析试验

在单因素试验基础上，以异丙醇质量分数、硫酸铵质量分数和体系pH值为自变量，肌动蛋白提取率为响应值，按照Box-Behnken设计进行响应面试验，因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Independent variables and their levels used in Box-Behnken design

1.3.6 双水相体系放大制备肌动蛋白

双水相体系放大500 倍，肌原纤维蛋白加入量分别为10%和30%，在异丙醇质量分数26%、硫酸铵质量分数11%、pH 9.0的条件下放大，制备肌动蛋白冻干粉。分离出上相经过35 ℃真空旋转蒸发20 min，4 ℃静置过夜，离心收集沉淀，蒸馏水透析后冻干得到肌动蛋白冻干粉。1.3.7 分析检测

1.3.7.1 SDS-PAGE分析

参照Laemmli[29]的方法，分离胶质量分数10%，浓缩胶质量分数5%，电极缓冲液含0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS。上样量为15 μL；开始电泳时浓缩胶电压为80 V，待样品进入分离胶后电压改为120 V。电泳结束后，取出胶片用考马斯亮蓝染色，用无水乙醇-冰醋酸脱色至背景清晰。

1.3.7.2 蛋白质量浓度的检测

考马斯亮蓝法[30]测定蛋白质量浓度。标准曲线测定：取洁净的试管，分别加入0.1 mg/mL标准牛血清白蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，依次加入蒸馏水补足体积至1 mL。各管加入5 mL考马斯亮蓝溶液，混匀后室温静置5 min，在595 nm波长处测定吸光度。用1 mL蒸馏水作为空白对照，制得标准曲线为y=5.81x+0.071，R²=0.999，线性关系良好，说明可用于肌动蛋白质量浓度的测定。

1.3.7.3 肌动蛋白纯度鉴定[31]

将冻干粉复溶为1 mg/mL的蛋白溶液，通过分析型反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）进行纯度鉴定，色谱柱：反相C18柱；进样体积：20 μL；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃，检测波长：214 nm。选用的流动相为：A液（纯水），B液（100%乙腈）。洗脱条件：0～5 min，0%～20% B；5～8 min，20%～40% B；8～15 min，40%～60% B；15～20 min，60%～20% B。肌动蛋白纯度按式（5）计算：

1.3.7.4 CE定量检测肌动蛋白

CE检测条件A[23]：未涂层熔融石英毛细管柱，有效分离长度44 cm；DAD：检测波长194 nm；CE压力进样0.5 psi×5 s；电压15 kV；分离温度25 ℃。运行缓冲液：10 mmol/L的四硼酸钠、50 mmol/L的SDS溶液，盐酸溶液调其pH 9.2。

CE检测条件B[24]：未涂层熔融石英毛细管柱，有效分离长度44 cm；运行缓冲溶液为20 mmol/L的PBS，pH 7.4，DAD：检测波长214 nm，分离电压10 kV，分离温度25 ℃，CE压力进样0.5 psi×5 s。

1.3.7.5 溶液配制

兔肌动蛋白溶液：称取0.001 1 g市售兔肌动蛋白，运行缓冲液溶解定容至0.5 mL，0.45 μm滤膜过滤后上机；透析液进样溶液：取肌动蛋白透析液0.5 mL，加入1 mL内标物对乙酰氨基酚（1 mg/mL），运行缓冲液定容至5 mL，0.45 μm滤膜过滤后上机；冻干粉进样溶液：冻干粉用运行缓冲液复溶，取2 mL，加入1 mL内标物对乙酰氨基酚（1 mg/mL），运行缓冲液定容至5 mL，0.45 μm滤膜过滤后上机。

1.3.7.6 肌动蛋白含量检测

冻干粉复溶液，加入内标物对乙酰氨基酚后进样，记录内标物和肌动蛋白的峰面积，按式（6）计算肌动蛋白含量：

式中：C为内标物的质量浓度/（mg/mL）；A1、A2分别为内标物和肌动蛋白的峰面积；N为稀释倍数；V为肌动蛋白定溶体积/mL；M为肌动蛋白冻干粉的质量/mg。

1.4 数据分析

肌动蛋白质量浓度平行测定3 次，用Excel 2007计算，结果用表示。应用Origin 8.5软件绘制相图、折线图及MECC-DAD图。

2 结果与分析

2.1 双水相体系的建立

2.1.1 3 种醇-盐双水相体系相图

本实验研究了不同分子质量的高聚醇PEG、小分子短链醇与磷酸氢二钾，异丙醇与3 种盐形成的双水相体系，采用浊点法绘制双水相体系的相图分别如图1～3所示。

图1 PEG-磷酸氢二钾体系相图Fig. 1 Phase diagrams of PEG/K2HPO4 ATPS

由图1可知，PEG 600与磷酸氢二钾体系的分相能力最好，在PEG 600质量分数范围5.4%～46%，磷酸氢二钾质量分数范围5.1%～24%均可以形成稳定的双水相。PEG 2 000～10 000与磷酸氢二钾体系分相能力较弱，其中PEG 4 000～10 000与磷酸氢二钾体系的相图几乎重合，说明PEG 4 000～10 000与磷酸氢二钾体系的分相能力相同。

由图2可知，磷酸氢二钾与乙醇、异丙醇的分相能力较好，在乙醇质量分数范围4%～34%，盐质量分数范围6%～48%都可以形成稳定的双水相；在异丙醇质量分数范围2.4%～30%，盐质量分数范围7%～48%都可以形成稳定的双水相。

图2 醇-磷酸氢二钾体系相图Fig. 2 Phase diagrams of alcohol/K2HPO4 ATPS

图3 异丙醇-盐双水相体系相图Fig. 3 Phase diagrams of isopropanol/salt ATPS

由图3可知，异丙醇与磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钠均可在较大质量分数范围内形成双水相。

2.1.2 2 种双水相体系对鳜鱼肌动蛋白分离的影响

2.1.2.1 PEG-磷酸氢二钾体系分离肌原纤维蛋白中的肌动蛋白电泳

按照1.3.3节中的方法配制不同分子质量的PEG与磷酸氢二钾双水相体系，如表2所示。加入肌原纤维蛋白后室温静置3 h，分离出上下相进行SDS-PAGE，结果如图4所示。

表2 PEG-磷酸氢二钾体系组成Table 2 Composition of PEG/K2HPO4 systems

图4 PEG-磷酸氢二钾体系提取肌动蛋白SDS-PAGE图Fig. 4 SDS-PAGE profile of actin extracted by PEG/K2HPO4 ATPS

由图4可知，PEG 600-磷酸氢二钾体系的上相有2 条带：肌动蛋白和原肌球蛋白；PEG 2 000～10 000与磷酸氢二钾体系的上相有2 条带：肌钙蛋白和原肌球蛋白。所有体系的下相均没有条带检出，所有体系均不能分离出肌动蛋白单条带。因此PEG-磷酸氢二钾体系不能满足本实验分离肌动蛋白的要求，在后续实验中不再采用PEG-磷酸氢二钾体系。

2.1.2.2 醇-磷酸氢二钾体系分离肌原纤维蛋白中的肌动蛋白有机溶剂的选择

按照1.3.3节中的方法配制不同短链醇与磷酸氢二钾双水相体系（表3），加入肌原纤维蛋白后室温静置3 h，分离出上下相进行SDS-PAGE，结果如图5所示。

图5 醇-磷酸氢二钾体系提取肌动蛋白SDS-PAGE图Fig. 5 SDS-PAGE profile of actin extracted by alcohol/K2HPO4 ATPS

表3 双水相提取肌动蛋白最佳有机溶剂的选择Table 3 Choice of optimum organic solvent for ATPS

由图5可知，正丙醇、异丙醇与磷酸氢二钾体系的上相只有肌动蛋白一条带，下相没有蛋白检出。其他体系的上相或下相不只含有肌动蛋白一条带。由表3可以看出，异丙醇-磷酸氢二钾体系提取肌动蛋白的提取率最高，达11.74%。因此，最佳有机溶剂选择异丙醇。

2.1.2.3 异丙醇-盐体系分离肌原纤维蛋白中的肌动蛋白无机盐的选择

按照1.3.3节中的方法配制不同无机盐与异丙醇双水相体系（表4），加入肌原纤维蛋白后室温静置3 h，分离出上下相进行SDS-PAGE，结果如图6所示。

图6 异丙醇-盐双水相体系SDS-PAGE图Fig. 6 SDS-PAGE profile of actin extracted by isopropanol/salt ATPS

表4 双水相提取肌动蛋白最佳无机盐的选择Table 4 Choice of optimum inorganic salt for ATPS

由图6可知，异丙醇-碳酸钠体系的上相含有肌动蛋白和肌球蛋白，异丙醇-硫酸铵体系和异丙醇-磷酸氢二钾体系的上相均只含有肌动蛋白一种蛋白，不含肌球蛋白等其他蛋白。由表4可知，异丙醇-硫酸铵体系的肌动蛋白提取率高于异丙醇-磷酸氢二钾体系，因此最佳无机盐选择硫酸铵。

2.2 单因素试验优化肌动蛋白提取条件

2.2.1 异丙醇质量分数对肌动蛋白提取率的影响

图7 异丙醇质量分数对肌动蛋白提取率的影响Fig. 7 Inf l uence of isopropanol concentration on actin extraction yield

双水相体系硫酸铵质量分数为10%，pH 7.0，加入肌原纤维蛋白溶液1 mL，考察不同异丙醇质量分数对肌动蛋白提取率的影响。由图7可知，当体系中异丙醇质量分数为28%时，肌动蛋白提取率最高，达15.88%，随着异丙醇质量分数的降低或者增加，提取率都随之降低。原因可能是由醇的亲水/疏水平衡值变化引起的[28]。醇类物质同时具有极性和非极性基团，与蛋白质分子的相互作用包含了亲水相互作用和疏水相互作用的平衡；可能随着醇用量的增加，上相中的亲水/疏水平衡值改变，进而影响肌动蛋白提取率。因此，双水相最佳异丙醇质量分数为28%。

2.2.2 硫酸铵质量分数对肌动蛋白提取率的影响

图8 硫酸铵质量分数对肌动蛋白提取率的影响Fig. 8 Inf l uence of ammonium sulfate concentration on actin extraction yield

双水相体系异丙醇质量分数为28%，pH 7.0，加入肌原纤维蛋白溶液1 mL，考察不同硫酸铵质量分数对肌动蛋白提取率的影响。由图8可知，随着体系中硫酸铵质量分数的增加，提取率降低。当体系中硫酸铵的质量分数为10%时，肌动蛋白提取率最高，达15.51%。可能是随着盐用量的增加导致下相体积增大、水增多，由于上相中水量减少致使上相的亲水/疏水平衡值降低。因此，双水相体系最佳硫酸铵质量分数为10%。

2.2.3 体系pH值对肌动蛋白提取率的影响

图9 体系pH值对肌动蛋白提取率的影响Fig. 9 Inf l uence of pH on actin extraction yield

双水相体系硫酸铵质量分数为10%，异丙醇质量分数为28%，加入肌原纤维蛋白溶液1 mL，考察体系不同pH值对肌动蛋白提取率的影响。体系pH值变化可以改变蛋白质表面的电荷，从而影响蛋白质在两相间的分布。由图9可以看出，随着pH值的增加，上相肌动蛋白的提取率先升高后下降，且在体系的pH值为8时，肌动蛋白提取率最高，为13.62%，随着pH值的改变，提取率随之降低，双水相体系最佳pH值为8。

2.2.4 肌原纤维蛋白添加量对肌动蛋白提取率的影响

图10 不同肌原纤维蛋白加入量提取肌动蛋白SDS-PAGE图Fig. 10 SDS-PAGE profile of actin extracted with different amounts of myofibrillar proteins

双水相体系硫酸铵质量分数为10%，异丙醇质量分数为28%，考察体系不同肌原纤维蛋白添加量对肌动蛋白提取率的影响。由图10可知，不同肌原纤维蛋白加入量的双水相体系上相主要蛋白成分为肌动蛋白。随着肌原纤维蛋白加入量的增加，杂蛋白逐渐开始出现。当加入量为20%时，开始出现杂蛋白d；当加入量为30%时，开始出现杂蛋白a；当加入量为40%时，开始出现杂蛋白b和c。研究表明，随着肌原纤维蛋白加入量增加，对双水相体系提取率有一定影响。

2.3 双水相提取肌动蛋白条件的响应面法优化

运用Design-Expert 8.0.6数据统计分析软件，选取硫酸铵质量分数、异丙醇质量分数和体系pH值3 个因素，采用3因素3水平的响应面分析方法对双水相提取肌动蛋白条件进行优化设计。以肌动蛋白的提取率为响应值。响应面试验设计与结果见表5。

表5 响应面优化双水相提取肌动蛋白试验设计与结果Table 5 Box-Behnken design in terms of coded data with experimental values of actin extraction yield

表6 各因素和回归方程的方差分析Table 6 Analysis of variance of the effect of various factors on actin extraction yield

运用Design-Expert 8.0.6数据统计分析软件对表5数据进行多元回归拟合，得到肌动蛋白提取率与异丙醇质量分数（A）、硫酸铵质量分数（B）和体系pH值（C）的二次多项回归方程：Y=10.48-1.10A-0.91B+1.66C-0.55AB+0.50AC-0.16BC-0.23A2-1.61B2+1.27C2。

由表6可知，回归方程模型的P值为0.015 2，差异显著，表明该方程拟合度较好。失拟项P值为0.356 9，差异不显著，模型不失拟，选择合理。各因素对肌动蛋白提取率的影响顺序为C（体系pH值）＞A（异丙醇质量分数）＞B（硫酸铵质量分数）。当优化条件为异丙醇质量分数26%、硫酸铵质量分数11%、pH 9.0时，模型预测肌动蛋白提取率可达为13.815 2%。为了检验预测模型的有效性，在最优工艺条件下进行3 次平行实验，肌动蛋白提取率为11.04%，略低于回归方程的预测值，标准偏差为1.39%。

提取的肌动蛋白和兔肌动蛋白采用SDS-PAGE法验证，结果如图11所示，各泳道均出现清晰的肌动蛋白条带。双水相上相溶液（泳道1）和兔肌动蛋白溶液（泳道5）显示出肌动蛋白一条带，无明显杂蛋白；肌动蛋白冻干粉溶液电泳图中（泳道3、4）显示有少量杂蛋白，推测在制备样品冻干粉过程中，少量蛋白变性及少量高分子肌动蛋白水不溶性。冻干粉水溶液经分析型RP-HPLC检测（图12），与溶剂空白对照，面积积分显示肌动蛋白冻干粉的纯度达到94.26%，表明双水相体系分离肌动蛋白的有效性。

图11 验证实验SDS-PAGE图Fig. 11 SDS-PAGE profile obtained in verification experiments

图12 溶剂空白（a）及肌动蛋白（b）HPLC图Fig. 12 HPLC chromatograms of blank (a) and actin (b)

2.4 肌动蛋白质量浓度分析与定量

2.4.1 双水相组成体系放大与肌动蛋白质量浓度分析

为了实现大规模制备样品，在响应面优化双水相体系组成体系的基础上，用考马斯亮蓝法检测双水相体系上相肌动蛋白质量浓度，结果如图13所示，不同实验条件下双水相体系上相的肌动蛋白质量浓度有一定的差异。当双水相体系组成为异丙醇质量分数26%、硫酸铵质量分数11%，pH 9.0时，肌动蛋白测定质量浓度最高，肌动蛋白提取率达到13.54%，因此后续在此条件下进行双水相体系放大实验制备肌动蛋白。

图13 考马斯亮蓝法检测肌动蛋白质量浓度Fig. 13 Actin concentration determined by Coomassie blue method

2.4.2.2 肌动蛋白样品进样模式对肌动蛋白出峰时间的影响

提取的鳜鱼肌动蛋白分别以冻干粉和透析液与内标物混合的形式进样，结果如图16所示。透析液进样模式下的内标物和肌动蛋白出峰时间分别为4.4 min和9.8 min；冻干粉进样模式下的内标物和肌动蛋白出峰时间分别为4.5 min和9.7 min。2 种样品进样模式下内标物和肌动蛋白的出峰时间没有差异，考虑到提取的鳜鱼肌动蛋白的保存，后续采用冻干粉进样模式对肌动蛋白定量。

2.4.2 CE法定量分析肌动蛋白

2.4.2.1 肌动蛋白分离条件选择与出峰时间确定

将兔肌动蛋白、鱼肌动蛋白分别溶解后进行CE法分析。由图14可知，在磷酸盐缓冲体系中，兔肌动蛋白和提取的鱼肌动蛋白出峰时间均在12 min左右；由图15可知，在四硼酸钠-SDS缓冲体系中，兔肌动蛋白和提取的鱼肌动蛋白的出峰时间均在10 min左右。肌动蛋白在四硼酸钠-SDS缓冲体系中的信号强度远高于磷酸盐缓冲体系中的强度，在实验中发现肌动蛋白易溶于四硼酸钠-SDS溶液而难溶于磷酸盐溶液，这是由于SDS具有吸附、增溶、形成胶束等功能[32]，可增加肌动蛋白的溶解度、减少蛋白在毛细管壁的吸附程度，提高电泳的分离速度。因此选择四硼酸钠-SDS缓冲体系对肌动蛋白定量检测。

图14 磷酸盐体系肌动蛋白的MECC-DAD图Fig. 14 MECC-DAD chromatogram of actin separated in phosphate buffer solution

图15 四硼酸钠-SDS体系肌动蛋白的MECC-DAD图Fig. 15 MECC-DAD chromatogram of actin separated in sodium tetraborate-SDS system

图16 鳜鱼肌动蛋白冻干粉（a）和透析液（b）进样的MECC-DAD图Fig. 16 MECC-DAD chromatograms of fish actin lyophilized powder (a)and dialysate (b)

2.4.2.3 肌动蛋白内标法定量分析

双水相体系放大500 倍，肌原纤维蛋白加入量分别为10%和30%，制备肌动蛋白冻干粉。研究中精确称取冻干粉溶于缓冲液定容至5 mL，各取2 mL冻干粉复溶液，加入1 mL对乙酰氨基酚内标物（1 mg/mL），运行缓冲液定容至5 mL，0.45 μm滤膜过滤后分别进样，记录内标物和肌动蛋白的峰面积，计算出肌动蛋白含量。

图17 内标物和冻干粉样品检测的MECC-DAD图Fig. 17 MECC-DAD chromatograms of internal standard and lyophilized powder sample

表7 CE定量检测肌动蛋白含量Table 7 Quantitative detection of actin content by MECC-DAD

由图17可知，内标物出峰时间为4.5 min；2 个批次肌动蛋白样品MECC-DAD图基线平稳，无杂峰干扰。由表7可知，肌原纤维蛋白加入量为10%和30%制备的肌动蛋白CE检测含量相近，每个样品3 次测定结果比较接近，重复性实验结果相对标准偏差均小于8%，重复性良好。

3 结 论

本实验筛选了高分子PEG-盐和低分子醇-盐2 种双水相体系提取鳜鱼肌原纤维蛋白中的肌动蛋白，结合SDS-PAGE和肌动蛋白提取率最终确定最佳分离体系为异丙醇-硫酸铵双水相体系。在单因素试验的基础上，利用响应面法分析确定了双水相提取鳜鱼肌动蛋白的最佳工艺条件：异丙醇质量分数26%、硫酸铵质量分数11%、pH 9.0。在此工艺条件下进行3 次平行实验，肌动蛋白提取率为（11.04±0.54）%，略低于模型预测值。毛细管胶束电动色谱MECC-DAD法研究结果显示，肌动蛋白的定量出峰时间约为10 min，CE图谱基线平稳无杂峰。肌原纤维蛋白加入量分别为10%和30%，放大制备肌动蛋白冻干粉，检测含量相近，实验结果相对标准偏差均小于8%，重复性良好。研究结果为名贵鱼类质量品质属性鉴定及鱼类肌动蛋白标准品的研制奠定基础，为鱼类蛋白功能开发利用及快速定量检测提供理论依据。