高原地区MS与基因测序对诺卡菌鉴定评价

巢世兰 阿祥仁 张倩

【摘要】目的：以基因测序（16s rDNA、rpoB）为金标准，评价飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对高原地区诺卡菌临床分离株的准确性研究及病例分析。方法：回顾性调查我院2015.1-2019.12月，5年临床标本中分离的16株诺卡菌，对比MS与测序的鉴定结果，将质谱法鉴定与基因测序法结果不一致的菌株维护进质谱数据库;剔除病例缺如者，共收集13例。结论：高原地区分离的13株诺卡菌中，肺部依然是主要感染部位。

【关键词】高原地区;MS;基因测序;诺卡菌

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究纳入该院2015.1-2019.12诊断为诺卡菌感染患者病例13例（其中1株MS仅能鉴定到属，与测序法结果不一致;维护MS菌库后，将脓液诺卡菌通过自建库功能添加至原菌库）。并对两种方法结果一致的13株菌进行临床特点分析。

1.2 方法

1.2.1 菌种鉴定

筛选出目标菌株，转种哥伦比亚血平板，在35℃条件下孵育培养72h。

1.2.2 诺卡菌常规实验室检查方法：革兰染色

弱抗酸染色为阳性、抗酸染色、镜下菌体为长丝状，菌丝常与菌体呈十字交叉。在培养基上36h后肉眼可见菌落，干燥白色或橙色菌落。

1.2.3 基因测序

使用TIANGEN TIAamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）制备细菌DNA。本研究采用的16s rDNA和rpoB扩增和测序方法是依照Carrasc研究中的引物和方法进行，16s rDNA扩增的正向引物和反向引物分别是5′-GCTTAACACATGCAAGTCG-3′和5′-GAATTCCAGTCTCCCCTG-3′，rpo B扩增的引物分别是5′-CGACCACTTCGGCAACCG-3′和5′-TCGATCGGGCACATCCGG-3′。PCR反应体系为25μL，包括：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5μL，上、下游引物共1μL，模板DNA 2μL，去离子水9.5μL。将扩增产物进行电泳分析及测通测序;测定序列在Genbank数据库中运用BLAST程序进行比对分析。

1.2.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MS）

使用全自动快速生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper，通过甲酸扩散法对所选13株菌株进行检测并记录数据。

2 结果

2.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MS）

应用MS鉴定诺卡菌的属准确度为100%（13/13），种准确度为92.3%（12/13），其中1株仅能鉴定到属与金标准不一致，详见表1。

2.2 基因测序

琼脂糖凝胶电泳显示16s rDNA扩增产物大小约为1400bp，rpoB基因扩增产物大小约为400bp，与目标片段大小一致。将测定序列在Genbank数据库中运用BLAST程序进行比对分析，比对结果见表1。

3 讨论

本研究对 MS鉴定诺卡菌菌种的准确度与16s rDNA和rpoB基因测序金标准比较并进行了评估，结果为应用MS鉴定诺卡菌的属准确度为100%（13/13），种准确度为92.3%（12/13），其中1例菌种鉴定结果与金标准不一致，且质谱评分较低1.436，说明鉴定结果可信度不高。将质谱法与基因测序法鉴定结果不同或无法鉴定到种的菌株维护进质谱菌种库后，再次以甲酸扩散法鉴定不一致的菌株，可鉴定到种，且质谱评分较高1.906，说明鉴定可信度高[1]。因此，MS用于诺卡菌鉴定最主要的局限性是现有商品化数据库中缺乏相应的图谱，所以实验室依据MS自建库功能，完善相应数据库，鉴定准确度可提高[2]。

基金项目：青海省创新平台建设专项 （2018-SF-L3），青海省人民医院院内课题

本研究纳入的13例久居高原的患者，均患有可能导致免疫力低下的基础疾病，最多见为肺部感染;其他可能导致免疫力低下的基础疾病还包括2型糖尿病、慢性乙型病毒性肝炎、AIDS、肾病综合症感染等。

综上，对于疑似诺卡菌感染的患者临床医师应及时多次送检，以便提高阳性率，实验室则应加强对诺卡菌种的鑒定能力，以指导临床准确诊治规范用药。

参考文献：

[1] 黄慧，陆志伟，徐作军.诺卡菌感染26例临床特点分析[J].中华结核和呼吸杂志，2010，33（9）：651-655. DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2010.09.005.

[2] 黄磊，张艺.诺卡菌分子鉴定方法的研究进展[J].检验医学与临床，2018，15（18）：2814-2817.