C 型钠钛对犬卵母细胞体外成熟效果的影响

刘晓静，秦毓敏，钟友刚，田树军*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.北京希诺谷生物科技有限公司，北京 102200；3.中国农业大学动物医学院，北京 100089）

关键字：C 型钠钛；犬卵母细胞；成熟率

犬卵巢上成熟卵泡排出的卵母细胞仍需要在输卵管内成熟2～3 d 才排出第一极体，这是犬卵母细胞区别于牛、羊、猪等其他物种的特点[1]。在犬卵母细胞成熟培养研究中，前人尝试在培养液中添加促性腺激素[2]、生长因子[3]、各种血清[4]等物质，采用与犬输卵管上皮细胞共培养[5]、将卵母细胞注入体外培养的输卵管内[6]等方法，但成熟率仍不超过20%。两步成熟法是先将卵母细胞放入减数分裂抑制剂中处理一段时间，再进行常规体外成熟培养[7]。亚胺环己酮、次黄嘌呤、环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP）类似物等均可在两步成熟法中作为减数分裂抑制剂，但属于非特异性抑制剂会对卵母细胞质量造成负面影响，从而降低卵母细胞的后续发育能力[8-9]。

C 型钠钛（C-type Natriuretic Peptide，CNP）是天然存在于小鼠卵泡中的一种生理性多肽，能够阻滞卵母细胞减数分裂的发生[10]。研究证实，CNP 能提高牛卵母细胞体外成熟率和囊胚发育率[11]，同时在猫上也得到证实[12]。犬卵母细胞中CNP 及其受体的分布与其他物种一致[13]，都是由壁层颗粒细胞分泌，通过与卵丘颗粒细胞上的受体结合来发挥作用。本研究采用两步培养法对犬卵母细胞进行体外成熟培养，对犬卵母细胞体外成熟体系中添加CNP 的适宜浓度和适宜处理时间进行筛选，以揭示CNP 对犬卵母细胞体外成熟效果的影响，并优化犬卵母细胞体外成熟培养体系。

1 材料与方法

1.1 试剂 M 199 培养基、胎牛血清和双抗为Gibco 产品；垂体促卵泡素和垂体促黄体素为宁波第二激素厂产品；其余试剂除特殊说明外均为Sigma 产品。

1.2 卵母细胞采集 在动物医院收集健康绝育犬的卵巢，置于37℃含有双抗的生理盐水中，在2～4 h 内运送至实验室，去掉多余组织，用生理盐水清洗3 次，放入割卵液（M 199+10%FBS）中用纵横切割法尽可能的释放卵丘卵母细胞，挑选卵丘细胞大于3 层、直径大于110 μm 且胞质暗黑均匀的卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte Complexes，COCs）进行体外成熟培养。

1.3 体外成熟培养方法及试验设计

1.3.1 CNP 影响犬卵母细胞核成熟进程的有效性验证将合格的COCs 随机分为2 组，分别放入事先平衡至少2 h 的对照组和实验组的成熟液微滴（100 μL）中，进行成熟培养，每个微滴培养15～20 枚COCs，培养条件为38.5℃、体积分数为5% CO2和饱和湿度。对照组和实验组分别在6、12、18、24 h 取出适量的COCs，进行核相观察。

对照组培养液成分为含10%FBS 的M 199、1 nmol/L半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸钠、1% 双抗。实验组培养液成分为含10%FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸钠、1%双抗、50 nmol/L CNP。

1.3.2 筛选适宜的CNP 处理浓度 将合格的COCs 随机分组，分别置入事先平衡至少2 h 的CNP 实验组（CNP浓度分别为50、100、500、1 000 nmol/L）的成熟液微滴（100 μL）中，进行6 h 的第1 步成熟培养；然后将其转入常规成熟液中进行时长为72 h 的第2 步成熟培养，期间每24 h 进行全换液。对照组在对照组培养液中成熟培养6 h，再在常规成熟液中成熟培养72 h，每24 h 进行全换液。于成熟培养结束时，对COCs 进行核相观察。

常规成熟液成分为含10 %FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸钠、0.8 IU 促卵泡素、2 IU促黄体素、1 %双抗。对照组处理液成分为含10 %FBS的M 199、1 nmol/L 半 胱 氨 酸、0.2 nmol/L 丙 酮 酸钠、1 % 双抗。实验组处理液成分为含10 %FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸钠、1 %双抗、CNP（50、100、500、1 000 nmol/L）。

1.3.3 CNP 处理的适宜时长研究 将合格的COCs 随机分组，放入CNP 浓度为100 nmol/L（经1.3.2 筛选得出）且事先平衡至少2 h 的成熟液微滴（100 μL）中，分别进行6、12、18、24 h 的第1 步成熟培养；然而将其转入常规成熟液中进行时长为72 h 的第2 步成熟培养，期间每24 h 进行全换液。于成熟培养结束时，对COCs进行核相观察。

1.4 卵母细胞染色判定核相

1.4.1 脱卵丘 将成熟的卵丘卵母细胞转入1% 透明质酸酶中处理1 min，期间用枪口光滑的移液枪不断轻轻吹打，然后将卵母细胞转移至成熟培养滴中，更换与卵母细胞直径相差不大的胚胎吸针，反复吹吸刮去卵母细胞周围的卵丘细胞，等卵丘完全去除后，用割卵液充分润洗3 遍，防止卵丘细胞影响核相的判读。

1.4.2 染色 用胚胎吸针将裸卵转移到10 mg/mL 的Hochest 33342 中进行5 min 避光染色。

1.4.3 核相判定 将染色后的裸卵在DPBS 中清洗3 遍，放入预先做好的成熟培养液微滴中，在倒置显微镜下，激发荧光，观察细胞核染色情况，拍照并对核相进行判定，记录不同时期卵母细胞的数量。

1.5 统计分析 结果用平均值±标准差表示，用统计软件SPSS 21.0 进行单因素ANOVA 检验。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 CNP 影响犬卵母细胞减数分裂进程有效性验证 体外成熟培养6、12、18、24 h 的犬卵母细胞 825 枚，分别脱卵丘染色并在荧光显微镜下观察核相。根据细胞核形态分为生发泡期（Germinal Vesicle，GV）、生发泡破裂期（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD）、第1 次减数分裂中期（Metaphase I，MI）、第2 次减数分裂中期（Metaphase II，MII）、退化期（Degeneration，DE）。各时期犬卵母细胞的核相特征如图1 所示，GV 期卵母细胞的核膜清晰可见；GVBD 期卵母细胞的核膜消失染色质扩散；MI 期染色质凝集在赤道面上；MII 期第一极体位于染色质附近或第一极体排除至卵周隙；DE 期则未见核物质，退化。从表1 可以看出，CNP 处理12 h组的存活率显著高于对照组，GVBD-MI 期卵母细胞的比率显著低于对照组，表明用CNP 处理12 h 后能提高卵母细胞的存活率，并且能够在一定程度上阻滞犬卵母细胞减数分裂；CNP 处理18 h 组处于GV 期的卵母细胞显著高于对照组，表明用CNP 处理卵母细胞18 h 后仍有阻滞卵母细胞减数分裂的作用。

2.2 不同浓度 CNP 处理对犬卵母细胞成熟效果的影响由表2 可知，500 nmol/L 组和1 000 nmol/L 组的存活率、GV、GVBD、MI 和MII 时期卵母细胞比例均极显著低于对照组，DE 的卵母细胞比例极显著高于对照组，表明高浓度的CNP 预处理不利于犬的体外成熟（In Vitro Maturation,IVM），并且能增加卵母细胞的退化率。50 nmol/L 组和100 nmol/L 组的存活率、GV、GVBD时期卵母细胞所占比率差异不显著，但50 nmol/L 组MII 期卵母细胞所占比例显著低于对照组和100 nmol/L组。说明100 nmol/L CNP 预处理犬卵母细胞有可能会提高犬卵母细胞的成熟率。

2.3 CNP 处理不同时间犬卵母细胞对成熟率的影响如表3 所示，CNP 处理12 h 组的存活率、MII 以及DE时期卵母细胞所占比例均极显著高于对照组，说明用CNP 处理犬卵母细胞进行成熟培养是有利的；24 h 组存活率、GV 以及MII 时期比率均极显著低于对照组，说明用CNP 预处理长时间后不利于犬卵母细胞成熟培养；12 h 组存活率、MII 和DE 时期比率均极显著高于6 h 组、18 h 组和24 h 组，说明用CNP 预处理犬卵母细胞12 h 最利于犬卵母细胞体外成熟培养，可提其高体外成熟培养效果。

3 讨 论

在卵母细胞体外成熟过程中，细胞核和细胞质同时成熟才能保证卵母细胞在体外受精后胚胎的发育能力。CNP 通过壁层颗粒细胞细胞分泌和卵丘细胞上钠钛受体NPR2（Natriuretic Peptide Receptor 2，NPR2）结合，通过激活鸟苷酸环化酶将环三磷酸鸟苷（Cyclic Guanosine Triphosphate，cGTP）转化为环磷酸鸟苷（Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP），cGMP 通过细胞间隙进入卵母细胞内抑制磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）的活性，能够维持卵母细胞内高水平的cAMP，从而维持减数分裂阻滞。目前已有研究证实CNP 能够阻滞猫卵母细胞发生减数分裂[12]，CNP 处理卵母细胞可获得更高的成熟率并且卵母细胞体外受精率和囊胚率显著升高[11]。本研究进一步证实了CNP 在犬卵母细胞的体外培养上也能有效延后减数分裂的发生，12 h 组的GVBD-MI 卵母细胞占比显著高于对照组，存活率也显著高于对照组，表明CNP 在一定时间内能够阻滞犬卵母细胞发生减数分裂作用，并随着CNP 处理的时间增加，阻滞卵母细胞减数分裂的作用变得越来越弱，这与CNP 受体的数量下降有关[13]。

表1 CNP 影响犬卵母细胞核相进程有效性验证结果

表2 不同浓度 CNP 处理对犬卵母细胞成熟效果的影响

表3 CNP 处理不同时间犬卵母细胞对成熟率的影响

有研究证实，在犬卵巢上刚排出卵母细胞时输卵管液中孕酮含量很低，当卵母细胞成熟时才达到很高的浓度[14]。前人的一些实验直接添加促性腺激素培养，结果成熟率普遍很低，退化率也偏高[15]，推测与卵母细胞直接在含有一定浓度促性腺激素激素中进行成熟培养有关，这可能会加快卵母细胞的退化和死亡。本研究结果显示用CNP 处理犬卵母细胞适当的时间能够提高卵母细胞的存活率，是否与预处理阶段的成熟液中未加入促性腺激素有关则有待进一步研究证实。本研究根据犬特殊的生理特性，采用含有CNP 且不含促性腺激素的成熟液预处理犬卵母细胞进行第一步成熟培养，既可以阻滞细胞核成熟，又可降低卵母细胞发生退化和死亡的概率，然后再转入常规培养液进行第2 步成熟培养，使犬卵母细胞成熟率得到提高，与CNP 在猪、牛[11]、羊以及猫[12]上的研究结论类似。这很可能是因为CNP 延缓了缝隙连接蛋白解体加强了卵丘细胞和卵母细胞间通讯，推迟了卵母细胞减数分裂的重新启动，促进了卵母细胞核质发育的同步性，进而提高卵母细胞的发育能力。本研究为进一步探讨CNP 促进卵母细胞核质发育同步从而提高卵母细胞发育能力奠定了基础。

4 结 论

本实验条件下，犬卵母细胞在含有100 nmol/LCNP 的培养液中体外成熟12 h（第1 步成熟培养），然后转入常规培养液中继续培养72 h（第2 步成熟培养），可提高犬卵母细胞的体外成熟培养效果。