日粮添加亚麻籽对苏尼特羊肌纤维特性及肉品质的影响

侯普馨，侯艳茹，白艳苹，苏 琳，赵丽华，宝勒格，靳 烨,*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.乌拉特中旗农牧业局，内蒙古 乌拉特中旗 015300）

亚麻籽又称胡麻籽，是一种常见的油料作物，含有丰富的油脂和蛋白，其中油脂质量分数高达35%～45%，具有丰富的多不饱和脂肪酸，如α-亚麻酸和亚油酸等。亚麻籽除了含有丰富的油脂外，还含有含量较高的木酚素、维生素以及黄酮类、酚酸类等生物活性成分，具有抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病等作用[1-2]。在反刍动物中，由于瘤胃的氢化作用，使得肌肉中含有大量的饱和脂肪酸，不利于肉品质的改善，因此亚麻籽可作为优质的饲料添加剂[3-4]。

肌纤维是组成肌肉组织的基本单位，机体中肌纤维的数量在其出生时就已稳定，但肌纤维类型的组成易受到遗传、营养和生理等因素的影响而发生转变[5]。大量研究表明，肌纤维类型的转化遵循I↔IIa↔IIx/d↔IIb的路径，许多动物的肌纤维都具有这样的双向转化潜力[6]。肌纤维的密度、数量、直径、横截面积等都与肉品品质密切相关[7]。尤其是当肉品中氧化型肌纤维所占比例较高时，肉品pH值、风味、颜色、大理石纹评分和肌内脂肪含量较高，肌肉系水力强、细嫩多汁，肉质良好[8]。目前通过改变肌纤维类型组成从而改善肉品质已经成为肉品科学领域的研究热点。

在动物生长发育过程中，营养物质通过消化吸收最终转化为肌肉和脂肪，养分的代谢过程必然涉及机体的能量和蛋白质代谢，并最终影响动物肉品质[9]。有研究表明，日粮中添加n-3系列多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）可以平衡动物体内n-3与n-6系列脂肪酸的比例，既促进了n-3 PUFA的吸收也利于人体健康[10-11]。Joo等[12]研究发现，日粮中添加共轭亚油酸使猪肉肌内脂肪含量增加，系水力提高，脂肪酸组成发生改变。蔡传江等[13]报道饲料中添加亚麻籽油能够显著提高猪背最长肌中α-亚麻酸、二十碳五烯酸和n-3 PUFA的含量。陶文君等[14]通过对育肥猪日粮中添加不同油脂发现，橄榄油组和亚麻油组中母猪的红肌纤维、肌间纤维、白肌纤维均显著高于去势公猪，且橄榄油组各类型纤维直径较亚麻油组有所提高。综上所述，日粮中添加不饱和脂肪酸对肉品质、肌纤维特性和脂肪酸组成均有不同程度的影响。因此，通过添加不饱和脂肪酸调控日粮营养进而影响肌纤维的转化是改善肉品品质的重要途径。

本实验分别运用ATPase染色法及肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）基因表达量对肌纤维进行分型，并测定琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）活力和肉品质指标，研究日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌肌纤维特性及肉品质的影响，旨在为改善肉品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗川井苏木镇选择3 月龄、体质量（16.94±1.29）kg、体况良好的纯种苏尼特羊20 只，随机分为2 组：亚麻籽组和对照组，每组10 只，公母各半。

亚麻籽 市售；异戊烷 阿法埃莎（天津）化学有限公司；巴比妥钠 山东西亚化学股份有限公司；醋酸钠、氯化钙、氯化钴 国药集团化学试剂有限公司；硫化铵 上海麦克林生化科技有限公司；腺苷-5’-三磷酸二钠盐 北京酷来搏科技有限公司；三氯甲烷北京化工厂；异丙醇 上海振兴化工二厂有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 大连宝生物工程有限公司；SDH、LDH测试盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

胴体肌肉pH值直测仪 德国Matthäus公司；C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学工程学院研制；TC-P2A全自动测色色差仪 北京奥依克光电仪器有限公司；MEV冰冻切片机 德国SLEE公司；DM4000B显微镜 德国LEICA公司；5417冷冻离心机德国Eppendorf生物公司；Biometra聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 北京北方华奥贸易有限责任公司；LightCycler®96实时荧光定量PCR仪 罗氏诊断产品（上海）有限公司；BG-power 3500型稳定温流电泳仪、水平电泳槽 北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad公司；UV-1800型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Synergy H1多功能微孔板检测仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

采用完全随机化设计，以日粮为实验处理。对照组日粮组成：精饲料10 kg、青贮饲料8 kg和葵花饼5 kg；亚麻籽组日粮：将亚麻籽按照对照组精饲料质量分数8%替代，添加于上述日粮中，混合并搅拌均匀。每月精饲料、青贮饲料、葵花饼分别增加2、8、5 kg。每日饲喂3 次，自由饮水。预实验期7 d，实验期3 个月。

1.3.2 肉品质指标测定

分组前测量体质量，记录月增体质量。羊屠宰45 min后，测定胴体质量、背最长肌pH值（pH0）、色差（L*值、a*值、b*值）、嫩度及蒸煮损失。将羊肉放置在排酸库排酸24 h后再次测定pH值（pH24）。

1.3.3 组织学特性测定

在羊屠宰1 h内，取左半胴体背最长肌，将肌肉顺肌纤维的方向切成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉块，先放入预冷的异戊烷中脱水干燥约30 s，再放入液氮中速冻，置于-80 ℃的冰箱中保存。将处理好的样品置于-25 ℃冰冻切片机中切成10 μm厚的横断面片。用ATPase（pH 4.6）组织化学染色法[15]进行染色。将染好的切片用Qwin V3纤维彩图分析软件分析肌纤维的各项指标（包括肌纤维密度、各类型肌纤维数量、面积、直径和横截面积），肌纤维总数不少于1 500 根。

1.3.4MyHC基因表达测定

1.3.4.1 RNA提取与反转录

在羊屠宰1 h内，取左半胴体背最长肌约100 mg装入无酶无菌冻存管中，放入液氮中冷冻，置于-80 ℃的冰箱中保存，用于总RNA的提取。运用TRIzol法按照RNAiso Plus试剂盒使用说明书提取肌肉中总RNA。将提取的总RNA用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用微量分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。目的基因MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx以及管家基因GAPDH引物引用参考文献[7,16]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.4.2 实时荧光定量PCR

以cDNA为模板，按照TB GreenTMPremix ExTaqTMII说明书配制PCR反应液，进行实时荧光定量PCR。用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测实时荧光定量PCR产物，凝胶成像仪拍照。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，ΔΔCt值按下式计算。

1.3.5 SDH和LDH活力测定

SDH和LDH活力均按照测试盒说明书进行测定。

1.4 数据统计与分析

实验数据使用SPSS 20.0软件的单因素方差分析和Pearson相关性分析进行差异性比较，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌肌纤维特性的影响

2.1.1 肌纤维ATPase染色结果

图1 苏尼特羊背最长肌ATPase染色结果（×100）Fig. 1 ATPase staining of LD in Sunit sheep from two groups (× 100)

根据肌纤维内ATP酶的酸碱稳定性差异通过ATPase染色法对肌纤维进行分类，亚麻籽组和对照组苏尼特羊背最长肌ATPase染色结果如图1所示。经ATPase染色后两组羊背最长肌肌纤维主要分为3 种类型：I型肌纤维（黑色）、IIA型肌纤维（浅色）和IIB型肌纤维（棕褐色）；其中I型肌纤维为慢速氧化型、IIA型肌纤维为快速氧化-酵解型、IIB型肌纤维为快速酵解型。

2.1.2 日粮中添加亚麻籽对不同类型肌纤维数量比例和面积比例的影响

图2 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌肌纤维数量比例（A）和面积比例（B）的影响Fig. 2 Effect of dietary linseed supplementation on percentage number (A)and area (B) muscle fibers of LD from Sunit sheep

由图2可知，亚麻籽组和对照组不同类型肌纤维数量比例无明显差异，其中亚麻籽组羊背最长肌I型肌纤维数量比例为9.41%，高于对照组，IIA型、IIB型肌纤维数量比例接近，低于对照组。亚麻籽组IIA型肌纤维面积比例为39.62%，高于对照组，IIB型肌纤维面积比例为53.78%，低于对照组。任阳[17]研究比较脂肪酸对肌纤维组成的影响发现，与饱和脂肪酸相比，日粮添加不饱和脂肪酸促进了肌纤维类型由酵解型向氧化型转化，使氧化型肌纤维比例提高。周锡红等[18]从蛋白角度研究发现，日粮中添加不饱和脂肪酸饲喂母猪，其后代仔猪肌肉中慢速氧化型（I型）肌纤维特异蛋白肌钙蛋白I-SS表达水平较高，氧化型肌纤维比例显著高于饱和脂肪酸组（P＜0.05）。由此可知，日粮中添加不饱和脂肪酸可以促进肌纤维类型由酵解型向氧化型转化，本实验中日粮添加亚麻籽后，苏尼特羊背最长肌中I型肌纤维比例有提高的趋势。

2.1.3 日粮中添加亚麻籽对不同类型肌纤维直径和横截面积的影响

动物出生后肌纤维总数量基本不再变化，生长发育主要是肌纤维直径与面积的增加。肌纤维直径受众多因素的影响，不同品种畜肉随着体质量的增加，肌纤维直径变大，但幅度有所差异；机体营养水平较低时，肌纤维直径较小[19-20]。由图3可知，亚麻籽组苏尼特羊背最长肌I型和IIB型肌纤维直径和横截面积均极显著小于对照组（P＜0.01），IIA型肌纤维直径也极显著小于对照组（P＜0.01），但IIA型肌纤维横截面积在两种饲养条件下没有显著差异（P＞0.05）。Migdal等[21]研究结果表明，日粮中添加共轭亚油酸可以显著降低红肌（I型）纤维数量和直径，与本实验结果相一致。但Emelie等[22]报道，老年女性通过膳食摄入n-3系列不饱和脂肪酸可引起II型肌纤维肥大，缓解肌肉质量下降的症状。以上研究结果不一致，可能是不饱和脂肪酸的类型、添加量、添加阶段和持续时间不同所致。

图3 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌肌纤维直径（A）和横截面积（B）的影响Fig. 3 Effect of dietary linseed supplementation on muscle fiber diameter (A) and cross-sectional area (B) of LD from Sunit sheep

2.2 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌MyHC基因表达量的影响

图4 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌MyHC基因mRNA相对表达量的影响Fig. 4 Effect of dietary linseed supplementation on relative expression of MyHC gene in LD from Sunit sheep

通过MyHC的差异表达对肌纤维进行分类的分子分型方式更为准确、可靠。依据MyHC的多态性可将肌纤维分为I型（慢速氧化型）、IIa型（快速氧化型）、IIx（或IId型，中间型）、IIb型（快速酵解型）[6]。由图4可知，亚麻籽组羊背最长肌MyHCI基因和MyHCIIx基因mRNA相对表达量均极显著高于对照组（P＜0.01），MyHCIIa基因和MyHCIIb基因mRNA相对表达量高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。与此一致，周锡红等[18]报道日粮中添加不饱和脂肪酸饲喂母猪，其后代仔猪中MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx基因表达量均显著提高。Wataru等[23]通过研究不同类型膳食油脂对大鼠肌纤维组成和相关代谢基因的影响发现，日粮添加鱼油可以显著提高MyHCIIx基因表达水平，降低MyHCIIb基因表达水平。

2.3 日粮添加亚麻籽后苏尼特羊背最长肌肌纤维比例与MyHC基因表达量的相关性

表2 肌纤维数量和面积比例与MyHC基因mRNA相对表达量的相关性Table 2 Correlation coefficients between relative expression of MyHC gene and muscle fiber type composition

由表2可知，MyHCI和MyHCIIa基因mRNA相对表达量均与I型和IIA型肌纤维数量比例和面积比例呈正相关。MyHCIIb基因和MyHCIIx基因mRNA相对表达量均与IIB型肌纤维的数量比例和面积比例呈正相关；说明MyHC基因表达量与ATPase组织化学染色法对肌纤维的分型结果基本一致。

2.4 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌SDH和LDH活力的影响

图5 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌中SDH和LDH活力的影响Fig. 5 Effect of dietary linseed supplementation on SDH and LDH activity in LD from Sunit sheep

肌肉的代谢类型通常分为氧化代谢和酵解代谢，I型肌纤维主要通过氧化代谢提供能量，II型肌纤维主要通过酵解代谢提供能量，肌肉中的SDH与LDH的活力在一定程度上可以反映肌肉的代谢状况[24]。SDH是三羧酸循环所有限速酶中唯一进入线粒体内膜的有氧代谢酶，是线粒体的标志性酶，常用于评价肌肉氧化活性[25]。LDH普遍存在于全身各组织细胞中，是机体糖酵解功能系统的关键酶之一，其活性可反映细胞内无氧酵解的活跃程度[26]。由图5可知，亚麻籽组羊背最长肌SDH活力极显著高于对照组（P＜0.01），LDH活力极显著低于对照组（P＜0.01），这表明日粮中添加亚麻籽可以提高苏尼特羊背最长肌中SDH活力、降低LDH活力，从而提高肌肉的氧化代谢水平。

2.5 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌肉品质的影响及肌纤维特性与部分肉品质的相关性分析

表3 日粮中添加亚麻籽对苏尼特羊背最长肌肉品质的影响（n＝10）Table 3 Effect of dietary linseed supplementation on meat quality of LD from Sunit sheep (n = 10)

由表3可知，亚麻籽组羊背最长肌L*值极显著低于对照组（P＜0.01），亚麻籽组羊屠宰后背最长肌初始pH0值为6.56，显著高于对照组（P＜0.05），经静置排酸24 h后，对照组羊背最长肌pH24值为5.72，极显著高于亚麻籽组（P＜0.01）。亚麻籽组羊背最长肌剪切力极显著小于对照组（P＜0.01）。两组之间其他肉品质指标无显著差异。Migdal等[21]研究日粮中添加共轭亚油酸对皮特兰猪肉品质的影响，发现日粮中添加质量分数2%的共轭亚油酸不改变猪的肥育效果和屠宰性能，也未对肉的某些性状和食用品质产生影响，与对照组相比，仅肉的风味、L*和b*值存在显著差异。Nuernberg等[27]研究比较了在日粮中添加橄榄油和亚麻油对生长肥育杂交猪肉品质的影响，结果表明，饲喂较高含量的单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸的植物油对胴体和肉质性状均没有显著影响。

表4 肌纤维特性与部分肉品质的相关性Table 4 Correlation coefficients between muscle fiber characteristics and meat quality

肌纤维是肌肉组织的基本组成单位，其类型是决定肉品质的一个重要因素。肌纤维的数量、直径、横截面积、不同类型肌纤维的数量比例以及面积比例都与肉品质密切相关[7]。由表4可知，L*值与IIB型肌纤维的比例、直径、横截面积呈正相关。IIB型肌纤维属于白肌，其细胞色素和肌红蛋白含量较少，外观呈白色，因此当肌肉中IIB型肌纤维所占比例较高时，肌肉L*会增加[6]。pH值是评定肉质的重要指标之一，动物宰后进行糖酵解代谢是其pH值下降的主要原因，而不同类型肌纤维的糖酵解潜力各不相同。本研究结果显示，亚麻籽组羊背最长肌pH0值显著高于对照组（P＜0.05），pH24值极显著低于对照组（P＜0.01）；pH0值与IIA型肌纤维比例呈正相关，与IIB型肌纤维比例呈负相关，pH24值与I型、IIA型肌纤维比例呈正相关，与IIB型肌纤维比例呈负相关。林在琼[28]的研究同样得出，宰后24 h巴美肉羊的pH值与IIA型肌纤维比例呈正相关，而与IIB型肌纤维比例呈负相关。亚麻籽组pH0值高于对照组，可能是由于亚麻籽组肌肉中I型肌纤维数量比例、IIA型肌纤维数量和面积比例均较对照组高，其中I型肌纤维中线粒体数目较多且糖原含量较低，糖酵解潜力也较低[29]，所以pH0值较高。在排酸24 h后，对照组pH24值极显著高于亚麻籽组，这可能是由于酵解型肌纤维中钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的比值较氧化型肌纤维大，因此酵解型肌纤维的成熟速率更快[30]，对照组中II型肌纤维较多，使得pH值回升较快。肌纤维类型可以通过肌纤维直径差异影响肉的嫩度。刘冰[31]研究得出，肌纤维直径与剪切力呈正相关，即肌纤维直径越小，剪切力越小，肌肉越细嫩。Kim等[32]研究发现IIb型肌纤维直径与眼肌面积呈正相关，与嫩度呈负相关。郎玉苗[33]研究发现，肌纤维直径和面积与剪切力和硬度呈显著正相关，提高I型肌纤维比例和降低II型肌纤维比例能够改善牛肉嫩度。本研究结果显示，亚麻籽组羊背最长肌的剪切力极显著小于对照组（P＜0.01），即亚麻籽组羊肌肉更加细嫩，3 种类型肌纤维直径和横截面积与剪切力呈极显著正相关（P＜0.01），随着肌纤维直径和横截面积的增大，剪切力随之增大，嫩度降低；I型肌纤维数量比例、IIA型肌纤维比例与剪切力呈负相关，IIB型肌纤维比例与剪切力呈正相关。总体而言，日粮添加亚麻籽通过改变肌纤维的直径，提高氧化型肌纤维比例和降低酵解型肌纤维的比例，对改善肉的嫩度具有积极作用。

3 结 论

本研究结果显示日粮中添加亚麻籽饲喂苏尼特羊，对降低羊肉L*值、提高嫩度发挥着积极作用，肌肉的氧化代谢水平明显提高，各类型肌纤维的直径和横截面积均较小。通过ATPase染色法和根据MyHC mRNA相对表达量的肌纤维分型结果均表明，日粮添加亚麻籽后，羊背最长肌中I型肌纤维比例有提高的趋势，提示酵解型肌纤维向氧化型肌纤维转化。因此，日粮中添加亚麻籽进一步影响了羊肉肌纤维特性，改善肉品品质。目前，为适应草原畜牧业持续发展，羊养殖方式由放牧逐渐转变为舍饲，因此通过调控日粮营养改善畜肉品质将是未来的研究重点。