植物乳杆菌67干预频次及周期对高脂血症大鼠血脂的影响

黄玉军，姚 瑶，周 帆，顾瑞霞*

（扬州大学 江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏 扬州 225127）

高脂血症是由于机体脂质代谢异常而引起的一种疾病，是引发动脉粥样硬化等心血管疾病的重要原因[1-3]。随着国民生活水平的提高和大众饮食习惯的改变，近年来血脂异常人数急速上升[4]，与血脂代谢异常相关的疾病频发，每年全世界与高血脂症相关疾病导致死亡的人数达到3 000多万，且患病率和死亡率仍在上升[5-6]。他汀类药物能够有效降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity liptein cholesterol，LDL-C）水平，在治疗代谢性疾病和心脑血管疾病中有重要的地位[7]。但随着研究的深入，这类药物带来的副作用也逐渐被发现，他汀类药物会造成肝损伤[8]、肾衰竭[9]等不良反应。随着药物副作用越来越多地被报道，益生菌作为药物替代品用于降胆固醇已成为研究热点。

近年来，国内外相关研究表明，益生菌有许多健康功效，如调节胃肠道健康、抑制病原微生物、增强免疫应答和降低血清胆固醇等[10-13]，最重要的是能有效控制血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、总甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensity liptein cholesterol，HDL-C）和LDL-C水平，有一定的降脂作用[14-16]。关于益生菌的动物实验基本均采用连续定时定量灌胃[17-19]，这种灌胃方式虽然能确保实验动物每日定量摄入益生菌，但缺乏实际操作性。对于普通人群来说，较难做到每日定时定量食用益生菌，并且容易产生心理厌倦。因此，本实验参考近年来被研究证明具有减肥作用且安全的“间歇性断食法”[20-22]，利用具有较好降胆固醇效应的益生菌植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，Lp）67，通过改变干预频次提出了2 种新的干预方式，并从干预4、6 周和8 周3 个阶段分析益生菌干预频次和周期对高脂血症大鼠血脂的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

体质量150～180 g的5 周龄SPF级Wistar雄性大鼠（n＝126；生产许可证号：SCXK（苏）2002-0009；使用许可证号：SYXK（苏）2002-0045） 扬州大学比较医学中心。

基础饲料（20%（质量分数，下同）面粉、10%米粉、20%玉米、26%麸皮、20%豆料、2%鱼粉、2%骨粉）、高脂饲料（78.8%基础饲料、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆盐） 南京协同生物医药有限公司。

Lp67由扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制实验室分离保藏；TC、TG、LDL-C、HDL-C检测试剂盒南京建成生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-250B型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；Legend mach1.6R高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；7020型全自动生化分析仪 日本日立制作所。

1.3 方法

1.3.1 灌胃菌液的制备

灌胃前3 d将-80 ℃保存的冻干菌粉取出进行活化，灌胃前1 d将活化3 代的菌株培养液于4 500 r/min离心15 min，用生理盐水清洗并重悬2 次，配制活菌数为108CFU/mL的菌悬液，置于4 ℃冰箱保存。根据大鼠体质量，以1 mL/100 gmb计算灌胃剂量。

1.3.2 动物分组及处理

动物房保持通风、透光、清洁卫生，室温（23.0±1.0）℃、相对湿度（50±5）%条件下适应性饲养7 d。适应期结束后，按各组间大鼠平均体质量无差异分为正常组（n＝27）和高脂组（n＝99）。正常组饲喂基础饲料，高脂组饲喂高脂饲料4 周进行高血脂症大鼠造模。造模成功后将高脂组大鼠按体质量无差异分为4 组：模型组（n＝24）、Lp67菌株5:2干预组（n＝24）、Lp67菌株隔日干预组（n＝24）及Lp67菌株连续干预组（n＝24）。灌胃4、6 周和8 周时，各组随机选取8 只大鼠进行指标测定。各组大鼠具体灌胃信息如表1所示。

表1 实验分组与干预方式Table 1 Experimental grouping and intervention treatments

1.3.3 主要指标的测定

1.3.3.1 观察大鼠生长状态

实验期间观察大鼠皮毛、活动及粪便等情况，每周固定时间称量1 次体质量。

1.3.3.2 脏器指数计算

大鼠禁食12 h后，称量并记录空腹体质量（m1/g），脱臼处死，解剖后取完整的心脏、肝脏、脾脏和肾脏，洗净血液，吸干水分后称质量（m2/g）。按式（1）计算脏器指数。

1.3.3.3 血清制备与血脂水平检测

大鼠禁食12 h后，脱臼处死，眼球取血，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，收集上层血清，取300 μL血清样品用全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C浓度。按式（2）计算动脉粥样硬化指数（atherosclerosis index，AI）。

1.4 数据处理与分析

实验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件中的方差分析进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 高脂血症大鼠模型的建立

饲喂第4 周，对照组和模型组随机各选取3 只大鼠，测定血清TC、TG、LDL-C及HDL-C浓度。

表2 益生菌Lp 67干预前大鼠血脂状况（n＝3）Table 2 Blood lipid indexes of rats before probiotic Lp 67 intervention (n= 3)

由表2可知，与正常组相比，模型组大鼠血清TC、TG和LDL-C浓度显著升高（P＜0.05），HDL-C浓度显著下降（P＜0.05），表明造模成功。

2.2 益生菌干预期间大鼠的一般行为学观察结果

图1 益生菌Lp 67干预期间大鼠体质量变化（n＝8）Fig. 1 Changes in body mass rats during probiotic Lp 67 intervention (n = 8)

体质量是最直观的可用于观察机体是否发生病变的指标。如图1所示，干预前4 周，各组大鼠体质量逐渐增长，但变化不大；干预4～6 周时，各组大鼠体质量均呈先降低后升高的趋势，且不论有无益生菌干预，大鼠体质量均出现低谷，说明可能此时机体自身的应激机制发挥作用，控制体质量增长，益生菌Lp67干预组则是由益生菌作用和自身应激机制叠加作用，因此，3 组干预组大鼠体质量均低于模型组，且5∶2干预组大鼠体质量最低，说明该组的益生菌干预方式和自身机体机制共同作用控制体质量增长的效果最好；干预6 周后，模型组大鼠体质量持续增长，干预组大鼠体质量增速减缓，说明益生菌干预有助于控制体质量增长，这与张晓磊等[23]的研究结果一致。与其他干预组相比，5∶2干预组大鼠体质量较高，说明5∶2干预组的干预方式不适合用于长期干预，连续和隔日干预组大鼠体质量后期波动较大，这可能是由于大鼠机体损伤较严重导致。综合考虑时间、菌株利用率和机体健康状态等，对高脂血症大鼠体质量干预效果最好的是Lp67菌悬液1 周干预5 次的5∶2干预组，最佳干预时间为4～6 周。

2.3 益生菌干预频次及周期对大鼠脏器指数的影响

脏器指数能进一步说明内部器官是否受损[24]，当人或动物营养状况出现异常时，脏器外观、质量等会发生改变[25]。对脏器外观进行观察发现，除了肝脏，其余脏器并无发生肉眼可见的病变，这与王琼等[26]的研究一致。正常组大鼠肝脏呈鲜红色，外部光滑有色泽，边缘清晰，模型组与干预组大鼠肝脏颜色发白、无光泽，且体积变大。

表3 益生菌Lp 67干预4 周后大鼠的脏器指数（n＝8）Table 3 Visceral organ indexes of rats after 4 weeks of probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

表4 益生菌Lp 67干预6 周后大鼠的脏器指数（n＝8）Table 4 Visceral organ indexes of rats after 6 weeks of probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

表5 益生菌Lp 67干预8 周后的大鼠脏器指数（n＝8）Table 5 Visceral organ indexes of rats after 8 weeks of probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

由表3～5可知，干预4～8 周大鼠各脏器指数变化情况大致相同，各组大鼠的心脏、脾脏和肾脏指数均无显著差异（P＞0.05）；与模型组相比，干预组大鼠肝脏指数均显著降低（P＜0.05）。肝脏指数增大，说明饲喂高脂饲料造成大鼠肝脏脂肪堆积、增生和肥大等问题，但对心脏、脾脏和肾脏的影响较小。干预4 周和6 周后，3 组干预组大鼠的肝脏指数均显著低于模型组，且组间均表现为连续干预组＞5∶2干预组＞隔日干预组的规律。干预8 周后，隔日干预组大鼠肝脏指数上升幅度较大，连续干预组大鼠肝脏指数上升幅度较小，因此灌胃结束时，隔日干预组大鼠肝脏指数最大，5∶2干预组次之，连续干预组最小，与干预4～6 周不同，说明隔日干预组和连续干预组这2 种干预方式的稳定性较差。因此，选择较稳定的5∶2干预组更有利于肝脏的恢复。此外，干预4 周时，5∶2干预组大鼠肝脏指数与模型组差异较大，这与文献[27]中报道的益生菌干预1 个月有利于减少肝脏脂肪堆积的结果一致；干预6 周时大鼠肝脏指数与模型组相比差值减小，至干预8 周时差值进一步减小，这可能是由于实验前期肝脏病症较轻，干预作用较明显。综上所述，Lp67菌悬液1 周干预5 次的5∶2干预组肝脏指数变化最稳定，且干预6 周后的肝脏情况最好。

2.4 益生菌干预频次及周期对大鼠血脂的影响

血清TC、TG和LDL-C水平的升高均是引起动脉粥样硬化的危险因素，TC、TG、LDL-C及HDL-C水平是临床用于诊断高脂血症的重要指标[28]。AI是医学上用来衡量动脉粥样硬化程度的指标，AI高则心血管疾病的发病率高[29]。

表6 益生菌Lp 67干预期间的大鼠血脂指标变化（n＝8）Table 6 Changes in serum biochemical indicators of rats during probiotic Lp 67 intervention (n= 8)

由表6可知，干预期间，与模型组相比，各干预组血清TC、TG、LDL-C浓度及AI均显著下降（P＜0.05），HDL-C浓度不同程度地升高，这一结果与韦云路[30]、张泽生[31]等的研究结果一致。干预期间，各干预组大鼠血清HDL-C浓度持续升高且升高幅度也不断增大，干预6 周和8 周时5∶2干预组大鼠血清HDL-C浓度与正常组最接近。干预8 周的连续干预组大鼠血清LDL-C浓度改善效果最佳，其次是干预8 周的5∶2干预组。干预6 周的5∶2干预组与模型组相比，TC浓度相差最大，其次是干预8 周的连续干预组和5∶2干预组。对于血清TG浓度，干预6 周的5∶2干预组改善效果最佳，与模型组相比差异最为显著。此外，5∶2干预组大鼠干预期间AI先降低后升高，AI在干预6 周最低，说明以5∶2干预组的方式干预6 周后大鼠发生心血管疾病的风险最低。综上所述，Lp67菌悬液1 周干预5 次的5∶2干预组干预6 周，对高脂血症大鼠血脂状况的改善效果最好、影响最显著。以上结果表明，益生菌干预改善血脂状况对干预时间依赖性较弱，可能更需要考虑所选用菌株及干预频次。

3 结 论

本研究通过建立高脂血症大鼠模型，利用实验室分离保藏具有较好体外降胆固醇作用的Lp67，结合近年来被认为可用于减肥人群使用且安全性较高的“间歇性断食法”，设计了2 种干预方式，从体质量、脏器指数及血清血脂生化指标方面分析益生菌Lp67干预频次及周期对高脂血症大鼠血脂的影响。结果表明，Lp67 1 周干预5 次对降低高脂血症大鼠体内胆固醇有一定改善作用，且综合考虑各项指标可知，作用周期以干预6 周为最佳。本实验结果为益生菌间歇性干预降低高脂血症大鼠血脂的研究提供了依据，并为提高益生菌的利用率提供了数据支持，但该种干预方式是否为人体最佳的益生菌食用方式仍有待进一步验证。