除磷微生物固定化处理工艺的优化

张雅婷　熊慧　羊晨　梁国辉　魏宝阳　李立恒

摘要 为了有效去除污染水体中磷含量，采用吸附剂结合聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）作为复合载体固定化除磷微生物。通过研究固定化小球的成球效果、机械强度和传质性能，确定了聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）的最佳浓度配比为10%聚乙烯醇和0.5%海藻酸钠。比较不同复合固定化微生物载体的物理参数，确定以除磷树脂作为吸附剂时除磷效果最佳。对制备的固定化微生物进行不同理化条件的废水模拟，确定最适除磷条件为25 ℃左右、pH中性、转速160 r/min，处理72 h后，除磷率可达80%左右。

关键词 除磷微生物;固定化载体;地衣芽孢杆菌;固定化条件优化

中图分类号 X703文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）13-0093-03

Abstract In order to effectively remove the phosphorus content in the polluted water， the adsorbent is combined with polyvinyl alcohol （PVA） and sodium alginate （SA） as a composite carrier to immobilize the phosphorus removal microorganisms.By studying the ball formation effect， mechanical strength and mass transfer performance of the immobilized pellets， the optimal concentration ratio of polyvinyl alcohol （PVA） and sodium alginate （SA） was determined to be 10% polyvinyl alcohol and 0.5% sodium alginate.The physical parameters of different composite immobilized microbial carriers were compared to determine the best phosphorus removal effect when phosphorus removal resin was used as adsorbent.The immobilized microorganisms were prepared to simulate wastewater with different physical and chemical conditions， and the optimal phosphorus removal conditions were determined to be about 25 ℃， pH neutral， and speed 160 r/min. After 72 hours of treatment， the phosphorus removal rate could reach 80%.

Key words Dephosphorization microorganisms;Immobilized carrier;Bacillus licheniformis;Optimization of immobilization conditions

由于人口剧增、环境污染等问题[1-2]，大量氮、磷有机物随着废水注入江河湖海，氮、磷含量超标是致使水体富营养化[3-8]的主要原因。因此，研究污水處理技术来改善水生生态环境质量就显得十分重要[9-10]。

微生物固定化技术作为一种高效率低能耗技术，现成为国内外废水处理领域的研究热点[11-12]。固定化微生物修复技术具有以下特点：①微生物细胞固定时，可有效避免人为破坏生物酶活性以及生化反应的稳定性;②可以提高单位体积水体内的微生物密度;③固定化后的微生物能长期保持活性，在复杂环境条件下也能稳定地发挥高效性能，且可重复使用[13-14]。因此采用微生物固定化技术能在保证微生物作用情况下，回收固定化微生物，既经济又环保[15]。常见的固定化方法有吸附法、包埋法和交联法[16-17]，现多采用包埋法与交联法相结合[18-22]。该研究利用“除磷吸附剂-包埋-交联”相结合的复合固定化方法固定高效除磷菌，提高废水除磷能力，并有利于磷的回收，目前鲜见文献报道采用该方法进行高磷废水处理。

湖南农业大学生物科学技术学院微生物研究实验室前期筛选获得一株高效除磷地衣芽孢杆菌S21（Bacillus licheniformis），为了将其应用于水体时获得更稳定、高效的作用效果，该研究分析聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）的最佳浓度配比和不同吸附剂对固定化小球性能的影响[23]，筛选合适的固定化载体，以扩宽其应用范围[24-26];并对固定化微生物进行不同条件的废水模拟，得知该固定化微生物的最适除磷条件，为废水处理的工业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株S21筛选自湖南省长沙市芙蓉区浏阳河农业大学校医院边湖畔的湖水底泥。

除磷树脂、活性炭、新型除磷材料，蓝深科技有限公司;聚乙烯醇、海藻酸钠、硼酸、亚甲基蓝、氯化钙、氯化钠，国药集团化学试剂有限公司;废水模拟培养基：乙酸钠0.249 g、牛肉膏0.113 g、（NH4）2SO4 0.111 g、MgSO4·7H2O 0.205 g、FeSO4·7H2O 0001 g，蒸馏水500 mL，KH2PO4 0.020 g;发酵培养基：蛋白胨水培养基1 L，1.6%漠甲酷紫乙醇溶液1～2 mL，pH 7.6，121 ℃灭菌20 min。另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉），115 ℃湿热灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

TMP-510电子天平，湘仪天平仪器设备有限公司;BCD-286H冰箱，海尔集团;MJ-160C细菌培养箱，上海博讯实业有限公司;SS-325高压灭菌锅，TOMY.KOGYO.Co.Ltd.;722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;SW-CJ-1B（U）单人单面超净工作台，苏州设备净化有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;CR21G高速冷冻离心机，无锡凯派克斯科技有限公司;KG2C-1128电磁炉，康佳集团股份有限公司;恒温摇床，天津市欧诺仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 固定化微生物载体制备方法。

根据文献参考[23，25-28]，选择聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）的混合载体作固定化载体。聚乙烯醇（5%、7%、10%、13%）和海藻酸钠（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）按不同比例搭配，90 ℃加热并搅拌溶解，冷却至40 ℃制得混合胶体。用5 mL注射器向4%CaCl2饱和硼酸溶液（pH=6.7）逐滴滴加混合液，边滴边搅拌。交联24 h后，取出固定化小球，用蒸馏水和生理盐水冲洗3次，存放备用。

1.3.2 固定化微生物载体性能测定方法。

1.3.2.1 密度和直径的测定。电子天平称重量筒m1，将固定化小球倒入量筒称重m2，得到固定化小球重量m2-m1。倒入一定质量的蒸馏水且没过固定化小球，量得体积V，得到固定化小球体积V-V水，得到固定化小球密度ρ=（m2-m1）/（V-V水）。随机選取15个大小均匀的固定化小球，用游标卡尺测其直径，计算平均直径得固定化小球直径。

1.3.2.2 传质性能的测定。在50 mL蒸馏水中加入2滴亚甲基蓝溶液，以蒸馏水作为对照，在600 nm处测得亚甲基蓝溶液的OD值。然后加入30颗大小形态一致固定化小球，24 h后取出固定化小球，测定亚甲基蓝溶液的吸光度。通过放入固定化小球前后亚甲基蓝溶液的吸光度比较，可反映固定化小球的传质性能。

1.3.2.3 膨胀率的测定。从各组试验中取出等量固定化小球，用游标卡尺测出活化前直径，将其分别置于盛有100 mL活化液锥形瓶中，常温静置培养6 h，再测出活化后的小球直径，测得的小球平均直径与原小球平均直径之比即膨胀率。

1.3.2.4 机械强度的测定。从各组试验中取出等量的固定化小球分别置于存有20颗玻璃珠和100 mL活化液的锥形瓶中，160 r/min、振荡24 h后取出，计算完好颗粒与最初颗粒的比值，即固定化细胞的机械稳定性。每组3个平行，取平均值。

1.3.2.5 除磷率的测定。将固定化新型除磷材料分为包菌和不包菌2组，活性碳、除磷树脂进行同样处理，放入配制好的模拟废水培养基中，72 h后测其磷含量，计算除磷率。

1.3.3 固定化微生物废水模拟最适条件的方法。

1.3.3.1 最适温度。取30粒包菌量5%的固定化小球，投放于100 mL灭菌的实际废水中，设置温度梯度为15、25、35、45 ℃，于160 r/min、pH 7，培养72 h，测其除磷率。

1.3.3.2 最适pH。取30粒包菌量5%的固定化小球，投放于100 mL灭菌的实际废水中，设置pH梯度为3、5、7、9，于160 r/min、最适温度，培养72 h，测其除磷率。

1.3.3.3 最适转速。取30粒包菌量5%的固定化微生物，投放于100 mL灭菌的实际废水中，设置摇床转速梯度为0、80、160、240 r/min，于最适pH、最适温度，培养72 h，测其除磷率。

1.3.3.4 最适时间。取30粒包菌量5%的固定化微生物，投放于100 mL灭菌的实际废水中，于最适pH、最适转速、最适温度培养，每隔12、24、36、48、60、72、84、96、108 h测其除磷率。

2 结果与分析

2.1 固定化微生物载体制备

聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）按不同的比例制备固定化小球，对比其物理性能，确定最佳组合比例。结果如表1，由于聚乙烯醇浓度过高时，胶体黏度较高，不易成球，推针筒时感到吃力，并伴随严重的拖尾现象，使得固定化小球团聚。而当海藻酸钠浓度过低时，小球成球率不高，容易形成拖尾团聚现象。因此，聚乙烯醇的合理浓度在8%～10%，海藻酸钠的合理浓度在0.3%～05%，这种组合的小球仅少量破碎，大部分都未出现上浮和破碎现象，并且固定化小球能够稳定和长期运行。综合考虑表1，10%聚乙烯醇和0.5%海藻酸钠混合制备的固定化小球在成球效果、机械强度和传质性的综合表现最优。从经济和处理效果两方面考虑，确定此为固定化微生物的包埋载体的最佳配比。

2.2 固定化微生物载体性能测定

试验分别测定了固定化微生物活性炭、新型除磷材料、吸附树脂和固定化空白小球的载体性能，结果见表2。固定化小球的密度及直径都比较均匀，其密度均比水重，说明固定化小球具有良好的沉降性能。对比空白球，由于吸附剂的加入在空间框架起支撑作用，从而提高了载体的空隙率和渗透率，载体内部生长的微生物与基质有充分的接触机会和生长空间，因此复合固定化微生物的机械强度更高，具有更好的强度和稳定性。综合比较，除磷树脂作为吸附剂的固定化微生物除磷效果最好，选其应用于废水条件模拟。

2.3 固定化微生物废水模拟最适条件

2.3.1 温度对固定化微生物废水除磷的影响。

研究不同温度对固定化S21除磷效果的影响，结果见表3。固定化微生物最适的除磷温度在25～45 ℃，且高温下仍可以继续除磷，为处理工业高温废水提供了条件。推测在15 ℃以下的低温环境下，除磷菌大部分失去了活性，生理代谢缓慢导致除磷效果差。

2.3.2 pH对固定化微生物废水除磷的影响。

从不同pH对固定化S21除磷效果的影响（表4）可以看出，pH偏中性时固定化微生物废水除磷效果最好，推测过酸过碱的条件破坏了微生物的生长进而导致除磷效果差。

2.3.3 转速对固定化微生物废水除磷的影响。

从表5可以看出，随着转速的增加，固定化小球的与污水接触的比表面积增加，因此固定化微生物除磷效果增加，转速为160 r/min时除磷率可达78%。而转速过快可能会导致小球破裂，除磷效果降低。

2.3.4 处理时间对固定化微生物废水除磷的影响。

从处理时间对固定化S21除磷效果的影响（表6）可以看出，在处理前24 h内除磷率较低，处理60 h后的除磷率都达到了70%以上，处理72 h后除磷率达80%左右。

3 结论

该研究以海藻酸钠和聚乙烯醇为包埋载体，筛选除磷树脂作为吸附载体制备复合载体固定化除磷菌。通过固定化载体的选择试验，得到以10%聚乙烯醇+05%海藻酸钠+05%除磷树脂的比例混合制备的固定化微生物载体，在成球效果、机械强度、除磷率、传质性的综合表现最好。通过对固定化微生物实际废水除磷理化性质研究，确定固定化微生物最适除磷温度为25 ℃、最佳转速为160 r/min，最佳除磷酸碱度为中性，在除磷处理72 h后，除磷率可达80%左右。

该研究系统地探索了固定化工艺，对除磷菌的固定化进行了初步研究，但研究水平还只是停留在实验室水平，要实现固定化微生物技术的工业化，将其投入现实污水处理工程，还需要结合现有废水处理工艺，开发新型工艺技术。

参考文献

[1] 胡荣奖.绿化水景水体富营养化的治理方案的探究[J].管理学家，2010（1）：145-146.

[2] STEINBERG C E W，HARTMANN H M.Planktonic bloomforming Cyanobacteria and the eutrophication of lakes and rivers[J].Freshwater biology，1988，20（2）：279-287.

[3] 李乔，刘伟利.浅谈水体的富营养化[J].水利天地，2004（2）：31.

[4] 袁志宇，赵斐然.水体富营养化及生物学控制[J].中国农村水利水电，2008（3）：57-59.

[5] 刘静静.江汉平原湖泊面源污染效应及调控机制研究[D].荆州：长江大学，2012.

[6] 毛新伟，徐枫，徐彬，等.太湖水质及富营养化变化趋势分析[J].水资源保护，2009，25（1）：48-51.

[7] 孔繁翔，高光.大型浅水富营养化湖泊中蓝藻水华形成机理的思考[J].生态学报，2005，25（3）：589-595.

[8] 金相灿，屠清瑛.湖泊富营养化调查规范[M].2版.北京：中国环境科学出版社，1990.

[9] 成都市环保局.“水十条”打响水污染防治攻坚战[M].北京：中国环境出版社，1990.

[10] 宋旭，孙士宇，张伟，等.“水污染防治行动计划”实施背景下我国水环境管理优化对策研究[J].环境保护科学，2017，43（2）：51-57.

[11] 李静，谭月臣，洪剑明.固定化微生物技术处理废水[J].安徽农业科学，2010，38（25）：13981-13983.

[12] 陈涵冰.固定化聚磷菌薄片制备及其除磷效果的研究[D].福州：福建师范大学，2016.

[13] 王建龙.生物固定化技术与水污染控制[M].北京：科学出版社， 2002.

[14] JEON C，PARK J Y，YOO Y J.Novel immobilization of alginic acid for heavy metal removal[J].Biochemical engineering journal，2002，11：159-166.

[15] 徐亚飞.地衣芽孢杆菌在水产养殖中的应用研究进展[J].渔业研究，2018，40（1）：83-88.

[16] 张斌，梁小萌，田娇，等.固定化微生物技术在废水处理中的研究进展[J].科技信息，2010（11）：23-24.

[17] 李丽.生物质炭改性及其与微生物联合脱氮除磷研究[D].南京：南京大学，2015.

[18] 曹亚莉，田沈，赵军，等.固定化微生物细胞技术在废水处理中的应用[J].微生物学通报，2003，30（3）：77-81.

[19] 王青，张善锋.固定化微生物技术在废水处理中的应用[J].环境科学与管理，2008，33（11）：81-84.

[20] 王娜，闵小波，王云燕，等.固定化微生物废水处理技术及其发展[J].污染防治技术，2008，21（1）：62-65.

[21] 周林成，李彦锋，侯英凤，等.大孔载体固定化微生物处理污水研究[J].离子交换与吸附，2007，23（6）：531-539.

[22] 邢丽贞.固定化藻类去除污水中氮磷及其机理的研究[D].西安：西安建筑科技大学，2005.

[23] 曲洋，张培玉，郭沙沙，等.复合固定化法固定化微生物技术在污水生物处理中的研究应用[J].四川环境，2009，28（3）：78-84.

[24] CHEN K C，LEE S C，CHIN S C，et al.Simultaneous carbonnitrogen removal in wastewater using phosphorylated PVAimmobilized microorganisms[J].Enzyme and microbial technology，1998，23（5）：311-320.

[25] 沈耀良，黄勇，赵丹，等.固定化微生物污水处理技术[M].北京：化学工业出版社，2002：163-174.

[26] CHANG I S，KIM C I，NAM B U.The influence of polyvinylalcohol（PVA）characteristics on the physical stability of encapsulated immobilization media for advanced wastewater treatment[J].Process biochemistry，2005，40（9）：3050-3054.

[27] 李婧.以玉米秸秆吸附—包埋—交联的复合固定化方法固定微生物处理芘的研究[D].广州：华南理工大學，2012.

[28] 吕荣湖，郭召海，孙阳昭，等.包埋固定化微生物法处理含油废水研究[J].环境污染治理技术与设备，2006（1）：89-93.