北京地区银杏雌株花芽分化期间内源激素变化及其花芽分化发端时间的确定

王建红　李 广　车少臣　任桂芳　任斌斌　仇兰芬　仲丽

摘要 银杏是城市绿化的主要树种，也是重要的经济植物。银杏雌株大量结实造成的树势衰弱问题已严重制约了其在城市中的应用，银杏结实的大小年问题也严重影响到银杏果的产量和质量，调控银杏雌株的开花结实是解决上述问题的有效途径。应用ELISA法和HPLC法测定了银杏花芽期间内源激素变化规律，叶部喷施GA3法确定了花芽分化发端时间。研究结果表明：在银杏雌株花芽分化期间，全芽中6-BA、IBA、GA3、GA4、GA7、KT和ZT这7种内源激素的含量为4～75 ng/g，且均在6月2日出现最高或次高峰;在心芽中除IAA外，ZA、KT、6-BA、ABA、GA3、GA7和ZR这7种内源激素含量多在500 ng/g以上，GA3含量于6月4日最高达4 130 ng/g，ZA、ZR和ABA的含量在5月29日—6月4日呈现低谷;果枝心芽中6-BA、GA3和GA7的含量在5月29日—6月4日呈现高峰。内源激素在银杏雌株芽中的分布呈现从外围向中心浓度急剧增高的趋势。叶片喷施GA3试验确定北京地区6月2—10日为银杏雌株的花芽分化发端时间。研究结果为调控银杏雌株的花芽分化提供了调控截止时间和调控药剂参考。

关键词 ELISA;HPLC;外源赤霉素;花芽分化调控;激素分布

中图分类号 S792.95文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）13-0118-06

Abstract Ginkgo biloba L. is the main tree for city green and the economically important plant. And the mastfruiting regularly weaken its tree vigor which has seriously restricted its application in cities. The phenomenon of biennial bearing also seriously affects the yield and quality of ginkgo fruits， so it needs the regulation technology for ginkgo floral bud differentiation. The endogenous hormones contents during times of floral bud differentiation of ginkgo were measured with ELISA and HPLC. And the initiation times of floral bud differentiation of ginkgo were determined by spraying GA3 on foliar. Results showed that the contents of endogenous hormones 6BA， IBA， GA3， GA4， GA7， KT and ZT were 4-75 ng/g in the whole bud （WB）， and contents of all endogenous hormones appeared the peak or subpeak on 2 June. The contents of endogenous hormones ZA， KT， 6-BA， ABA， GA3， GA7 and ZR， were generally above 500 ng/g in the heart bud （HB）， except IAA， and the maximum value was 4 130 ng/g at GA3 on 4 June. Contents of endogenous hormones ZA， ZR and ABA appeared the valleys from 29 May to 4 June in HB of fruitbearing and leaf branch. Contents of endogenous hormones 6-BA， GA3 and GA7 appeared the peak from 29 May to June 4 in HB of fruitbearing branch， but only GA7 appeared the peak in HB of leaf branch. So the distribution of endogenous hormones contents showed a sharply increased trend from periphery to center in ginkgo female bud. The initiation differentiation times of floral bud of female ginkgo were from 2 June to 10 June determined by spraying GA3 on foliar in Beijing District. The results provided reference for the deadline and agents of regulating the floral bud differentiation of female ginkgo.

Key words ELISA;HPLC;Exogenous gibberellin;Regulating the floral bud differentiation;Distribution of hormones

銀杏（Ginkgo biloba L.）是现存种子植物中最古老的孑遗植物，是公认的“活化石”[1]。其高大挺拔和具长短枝的树形，独特叉形脉序和扇形叶，以及金黄的秋叶使银杏成为非常重要的观赏树种之一[2]，在园林绿化中被广泛应用;其果实富含蛋白质、氨基酸、脂肪、糖、维生素和核黄素等营养成分[3]，果实和叶片中含有防止衰老、抗癌、保护心血管系统和预防心血管疾病的类黄酮、内酯等功能成分[4]。《本草纲目》中记载，银杏“熟食温肺益气，定喘嗽，缩小便，止白浊;生食降痰消毒、杀虫”，因而作为经济树种被大量种植，仅山东郯城银杏果年产量达4 000 t，干叶产量达21 000 t，产值近23亿元[5]，银杏作为经济林种植面积十分巨大。

银杏喜湿润且排水良好的深厚土壤，不耐积水和土壤板结。但城市行道树土壤多透风透气性较差，导致作为行道树的银杏普遍出现夏季焦边、焦叶现象[6]，且雌株夏季焦叶、焦边率（94.2%）远高于雄株（37.4%）[7]，这与果实大量消耗树体中的水分和营养相关[8]，已严重影响了银杏的景观效果，成为制约银杏在城市中应用的最大障碍。而果用银杏林又需预防大小年的产生，提高其果实产量。为此，定向调控银杏雌株的结实量十分重要。

有报道表明，喷施植物生长调节剂（PGRs）可调控植物的花芽分化[9]，笔者研究了银杏花芽分化期前后内源激素的动态变化，以精确银杏的花芽分化发端时间，以及不同内源激素对银杏花芽分化的作用。

沙波[10]测定了11月24日至翌年4月8日银杏雌株大年树和小年树芽内的内源激素含量，并分析了各内源激素对银杏花芽分化的影响。但银杏花芽分化发端时间为5月初—6月初[11]，结论存疑。史继孔等[12]研究了5月初—10月中旬银杏芽内源激素的变化，但其取样周期为1月1次，花芽分化期间的取样点不足。为此，笔者通过银杏花芽分化前后1周取样1次的方法研究了其内源激素变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料

银杏雌株位于北京市园林科学院院内（116°28′21″E，39°58′52″N），胸径20～25 cm、高8～12 m，处于结果盛期，且大小年严重。选取当年结果量极大的3株雌株，采集其结果枝条上的芽，称为“果枝芽”;选取当年结果量极少的3株雌株，采集其枝条上的芽，称为“叶枝芽”。

1.2 仪器与试剂

酶联免疫仪：InfiniteF50酶标仪（瑞士帝肯贸易股份公司生产）。

高压液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司生产）。

标准品：ZA、ZR、KT、6-BA、IAA、ABA、GA3和GA7標准品为Sigma 公司提供的 HPLC试剂。

其他试剂：甲醇为高效液相色谱纯;其他试剂丙酮、石油醚、乙酸乙酯、乙酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠和明胶均为分析纯;2，6-二叔丁基对甲酚（2，6-Di-tert-butyl-p-cresol，BHT）为化学纯;试验用水为超纯水。

试剂1：在80 mL甲醇中加入20 mL超纯水，摇匀后加入1 g 2，6-二叔丁基对甲酚，现配现用，置于棕色瓶中，在4 ℃冰箱中预冷30 min。

试剂2：PBS缓冲液加入1%明胶，调pH至7.5。

1.3 试验材料获取及内源激素的提取与测定

5月中旬至6月下旬，约每周1次从果枝组和叶枝组银杏中上部枝条的东南西北4个方向上各选取1根3～5年生短枝[13]，共8根枝条。快速剪取具6片叶以上短枝饱满顶芽置于液氮中速冻，然后置于-60 ℃的超低温冰箱中保存。

1.3.1 ELISA法内源激素的提取。

将2017年样品芽剥去外侧褐色鳞片，剩余材料为直径3.5～5.0 mm的芽组织，称为“全芽”。

参照龚晓崇等[14]的方法提取银杏雌株果枝和叶枝芽的内源激素：准确称取0.500 0 g全芽样本，弱光下在研钵中加液氮磨碎，加入1 mL预冷的试剂1，4 ℃浸提过夜，4 ℃、6 500 r/min冷冻离心15 min，取上清液;残渣用0.5 mL试剂1浸提2 h，4 ℃、6 500 r/min冷冻离心15 min后取上清，合并上清，40 ℃氮吹至约0.2 mL，加入0.5 mL石油醚60～90 ℃ 萃取脱色3次，弃上层醚相，加入试剂1调节pH至6.0，乙酸乙酯萃取3次，收集上层乙酸乙酯相并氮吹至干，加入0.5 mL试剂2涡旋振荡溶解，经0.22 μm滤膜（上海密粒膜分离技术有限公司生产）过滤后待测。

2017年委托北京绿博源生物科技有限公司按照常规ELISA法，测定样品内6-BA、KT、ZT、GA3、GA4、GA7和IBA这7种内源激素的含量。

1.3.2 高效液相色谱法内源激素的提取。

将2018年样品芽剥去外侧褐色鳞片，继续剥去外围绿色组织，直至剩余直径1.0～1.5 mm的内部组织，称为“心芽”。

内源激素的提取除称取心芽样本重量为0.150 0 g及冷冻离心条件为7 500 r/min和10 min外，同ELISA法。

2018年委托北京绿博源生物科技有限公司按照高效液相色谱法，测定样品内ZA、ZR、KT、6-BA、IAA、ABA、GA3和 GA7这8种内源激素的含量。

1.4 ELISA检测方法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验法，即向预先包被各种植物生长调节剂抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终黄色。颜色的深浅和样品中的植物生长调节剂含量呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD），计算样品浓度。

1.5 色谱条件

色谱柱为AkzoNobel N.V.公司生产Kromasil C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为01%乙酸水∶甲醇=6∶4溶液（使用前用0.45 μm 滤膜抽滤），其他色谱条件为进样量10 μL，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，走样时间40 min，紫外检测波长254 nm。

1.6 花芽生理分化发端时间的确定

于2018年5月25—6月10日，每2 d 1次对20年生且结果量为大小年的银杏雌株的约10 cm中上部的小年大枝喷施0.1 g/L的GA3，每处理3根枝条。翌年4月中旬待对照银杏出现胚珠时，每处理随机剪取3根长有短枝的20 cm长的枝条，统计各处理时间银杏大枝的胚珠数量，分析银杏雌株的花芽生理分化发端时间。

2 结果与分析

2.1 2017年银杏雌株内源激素含量

由图1可知，2017年5月中旬—7月上旬，全芽中7种内源激素的含量为4～75 ng/g。其中果枝全芽中6-BA的含量极显著高于GA3和KT，二者又极显著高于IBA，GA7、GA4和ZT的含量之间无显著差异，且极显著低于其他4种内源激素;叶枝全芽中KT、6-BA和GA3的含量显著高于IBA、GA4、GA7和ZT。

果枝全芽中6-BA、IBA、GA3、GA4和GA7含量均在6月2日出现最高峰，KT和ZT含量出现次高峰;叶枝全芽中6-BA、GA3和GA4含量也均在6月2日出现最高峰，KT、ZT、IBA和GA7含量也均出现次高峰。因而，6月2日前后可能为北京地区银杏花芽分化的一个关键节点，即花芽生理分化发端时间。

叶枝全芽中KT、ZT、IBA和GA7均在6月21日出现最高峰，而果枝全芽中除GA7在6月21日出现一个平缓的次高峰外，其他6种内源激素均未出现最高峰或次高峰。6月21日前后可能为花芽形态分化初期。

果枝芽中6-BA、ZT、GA3和GA7这4种内源激素的含量均显著高于叶枝芽，但叶枝芽中KT的含量在6月29日前显著高于果枝芽。因此，在银杏花芽生理分化期至形态分化期之间，全芽中低含量的6-BA、ZT、GA3和GA7，高含量的KT有利于花芽分化。

2.2 2018年银杏雌株内源激素含量

由图2可知，2018年5月下旬—6月下旬，心芽中ZA、KT、6-BA和ABA这4种内源激素的含量均在500 ng/g以上，GA3和GA7含量在15～4 050 ng/g，IAA含量在100～600 ng/g，ZR含量在检测限以下（0.1 ng/g）至1 370 ng/g。

心芽中ZA、ZR和ABA的含量在5月29日—6月4日呈现低谷;果枝芽中6-BA、GA3、GA7的含量在5月29日—6月4日呈现高峰。因而，5月29日—6月4日可能为北京地区银杏花芽生理分化发端时间。

5月29日—6月4日，ZA、IAA和ABA的含量在果枝心芽和叶枝心芽之间无显著差异;但果枝心芽中ZR、KT、GA3、GA7和6-BA的含量极显著高于叶枝心芽。因而，心芽中低含量的ZR、KT、GA3、GA7和6-BA有利于银杏花芽的分化。

2.3 全芽与心芽内源激素含量比较

对比图1和图2中KT、6-BA、GA3和GA7的含量可知，心芽中KT和6-BA含量是全芽中的17.6倍～50.9倍;6月4日时，果枝心芽中GA3和GA7含量是2017年6月2日全芽的78.8倍和136.1倍，叶枝心芽是全芽的8.5倍和99.1倍。且全芽中其他内源激素的含量最高为75 ng/g以下，心芽中除IAA外其他内源激素的平均含量在500 ng/g以上。因而，内源激素在银杏芽组织中呈不均匀分布，且呈现出越靠近花原基内源激素含量越高的趋势。

2.4 银杏雌株的花芽生理分化发端时间 由图3可知，银杏雌株小年枝条在2018年6月2日前喷施高浓度GA3后，翌年其短枝上出现的胚珠数量极少，极显著低于对照（P<0001）;6月2—10日，同样喷施高浓度GA3，但随时间延后，其短枝上出现的胚珠数量急剧增多，且6月2、4、6日短枝上的胚珠数量均极显著低于对照（P<0001），6月8日短枝上的胚珠数量显著低于对照（P=0001），6月10日短枝上的胚珠数量与对照无显著差异（P=0451）。故可精确确定银杏雌株的花芽生理分化发端时间为6月2日前后。

3 讨论

3.1 植物花芽发端时间

植物成花过程分为3个阶段：诱导、唤起和发端[15-16]。花芽分化诱导是指植物通过翻译表达花芽分化相关基因引发成花过程的活动。花芽分化期又名花芽生理分化期，是一个成花因素积累过程，包含激素、载体、受体、细胞膜系统、促进或抑制因子、环境条件等因子的相互作用[16]。其长短已在生物进化过程中形成，是一个相对稳定的过程。若得不到充分时间进行生理转化，花芽就不能形成，一旦形成叶芽就不再转变为花芽，而花芽一旦形成，就不逆转为叶芽[17]。花芽发端是指被诱导的芽发育成为可识别的花芽而进入生殖发育，特征是生长点变平、变宽、变圆[16]。

目前对花芽分化发端时间的研究多通过切片法进行。如连翘（Forsythia suspensa）[18]、美洲黑杨（Populus deltoides）[19]、毛白杨（P.tomentosa）[20]和银杏雌株[11]等。切片法观察花芽分化时间常通过芽的形态来判断，未分化期芽的生長锥长、小而尖，分化初期芽的生长点逐渐变宽而后增大。但在形态分化初期的花芽顶端生长锥体积膨大较小，用徒手切片法难以观察到，因此切片法难以精确确定植物的花芽分化时间。如王冬梅[20]根据毛白杨花芽形态发生过程，推断北京毛白杨花芽发端时间大致在6月，8月出现花原基;陈旭辉等[18]推断天津连翘花芽分化期为5月中下旬至7月中旬;史继孔等[11]推断贵阳银杏花芽分化始于6月上旬，7月底为分化盛期。

由于在植物花芽分化发端前施用PGRs可干扰植物的花芽分化而分化为叶芽，在植物花芽分化发端后施用PGRs，植物的花芽分化不受干扰而正常发育为花芽[16，21-22]。本文通过研究银杏花芽分化过程中内源激素的变化规律，推断得到影响银杏花芽分化的主要内源激素和北京地区银杏花芽分化时间，翌年在此时间段前后每2 d施用1次影响银杏花芽分化的外源植物生长调节剂（PGRs），干扰银杏的花芽分化。研究结果表明，6月2日前施用GA3，几乎所有银杏雌株芽分化为叶芽，6月4—10日施用GA3，银杏雌株芽分化为花芽的数量从0.11个/cm枝条急剧增加到与对照1489个/cm枝条相似的1.484个/cm枝条。由此精确确定北京地区银杏雌株的花芽发端时间为6月2—10日。

3.2 GA对植物花芽分化的影响

植物的成花转变由多种信号途径控制，这些途径均又或多或少与内源激素和环境因子信号相关，而这些信号通常又被不同内源激素传递和/或调节。在不同内源激素途径中，赤霉素途径（GA pathway）起着主导作用，它通过GA调节的DELLA蛋白与其他开花途径联结，使DELLA蛋白成为不同信号蛋白的“通用交换模块”[23]。

GA可促进处于不适合开花条件下长日照和二年生植物的花芽分化[24]，外施GAs可促使处于短日照条件下长日照野生型拟南芥（Arabidopsis）成花[25]，促使苗期毒麦（Lolium temulentum）[26]和二年生植物甜菜（Beta vulgaris）[27]成花。但GA不能促进短日照植物成花[24]，外施GA3反而抑制草莓（Fragaria × ananassa）成花[28-29]。随后研究表明，GA在一年生和二年生植物的成花过程中起双重作用。即在成花诱导阶段起促进作用，而在花芽形态分化期起抑制作用[30]。然而GA在多年生被子植物苹果（Malus domestica）、柑橘（Citrus sinensis）、芒果（Mangifera indica）和麻疯树（Jatropha curcas）等植物的成花过程中[31-34]主要起显著抑制作用。如叶面喷施GA3可完全抑制温州蜜柑（Miyagawa waseunshu）[35-36]和龙眼（Dimocarpus longana）[37]的成花。GA在松科、柏科和杉科等裸子植物过程中又起显著促进作用，外施GA4/7可显著促进加勒比松（Pinus caribaea）[38]、红松（P.koraiensis）[39]和白云杉（Picea glauca）[40]雌球花，马尾松（Pinus massoniana）[41]雄球花、油松（P.tabulaeformis）[42-43]和花旗松（Pseudotsuga menziesii）[44]雌雄球花的成花。外施GA3可促进马尾松（P.massoniana）[41]雄球花、显著促进红松（Pinus koraiensis）[39]雄球花和北美乔柏（Thuja plicata）[45]雌雄球花的成花。但GA对银杏成花作用的影响尚未见相关文献报道，该研究结果显示GA3可显著抑制银杏胚珠的形成，不同于其他裸子植物。

3.3 银杏花芽生理分化期间芽中内源激素的分布

对植物花芽分化期间芽中内源激素PGRs变化规律的研究报道众多[46-50]，但尚未见内源激素在植物芽内分布的研究报道。

该研究通过ELISA法分别测定了结实量非常多枝条（果枝）和结实量极少枝条（叶枝）上的去除外围灰色鳞片后芽（全芽）的内源激素含量变化情况，以及通过高效液相色谱法测定了果枝和叶枝上的去除外围灰色鳞片和外围组织，仅留直径1.0～1.5 mm内部组织芽（心芽）的内源激素含量变化情况（内源激素含量超过ELISA法检测最高限）。研究结果显示，不论果枝还是叶枝，心芽中内源激素的含量多在500 ng/g以上，GA3最高可达4 050 ng/g以上。而果枝和叶枝全芽中内源激素含量为4～75 ng/g。因此，内源激素在银杏芽内的分布并不均匀，其浓度分布可能呈从外围向中心急剧升高的趋势。

3.4 内源激素含量与银杏花芽分化间的关系

激素平衡控制花芽发端假说提出较高的CTK/GA比值有利于植物花芽的分化[51]，在此基础上发展的Bangerth激素信号调节假说提出，植物从营养芽转向花芽发育为一个不可逆过程，需要通过植物激素瞬时变化进行调控[52]。抑制花芽发端的植物激素产生于正在发育果实的种子或旺盛营养生长的梢尖，花芽發端位点是营养芽，信号必须从正在发育果实的种子或旺盛营养生长的梢尖运输到营养芽，在营养芽中被转导为抑制花芽发端的效果。其中IAA、GA、CTK等植物激素是这一过程中的重要调控因子。运输到芽中的GA和IAA水平较高时，抑制芽分化为花芽[53-54]。

在银杏花芽发端（6月4日）期间，果枝和叶枝心芽中内源激素含量存在较大差异。果枝心芽中GA3和GA7含量极显著高于叶枝心芽，不利于银杏营养芽分化为花芽，同激素平衡控制花芽发端假说及Bangerth激素信号调节假说。但果枝心芽中IAA、KT和ZR的含量显著低于叶枝心芽，果枝中6-BA和ZA含量与叶枝差异不显著，果枝心芽中的CTK含量低于叶枝心芽，不同于激素平衡控制花芽发端假说及Bangerth激素信号调节假说中，低含量IAA和高含量CTK促进植物花芽发端的结论。由于果枝心芽中IAA含量在5月25日显著低于叶枝心芽，5月29日与叶枝心芽无显著差异，随后显著高于叶枝心芽，可能为银杏雌株花芽分化诱导期间需较低浓度的IAA，但花芽发端期间需较高浓度的IAA。果枝心芽中的CTK含量较低也可能是该研究检测的CTK种类较少，未检测可能为高含量的CTK种类。

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