超声辅酶法提取豌豆蛋白及其抗氧化活性研究

戴媛　张忠琴　乔思琪　冷进松

摘要 为优化豌豆蛋白提取工艺条件，深入了解其生理功能活性，拓宽豌豆蛋白的产品范围，以干豌豆为研究对象，采用超声辅酶法提取豌豆粉中的蛋白质，优化提取工艺条件并测定提取产物的体外抗氧化活性。在试验范围内，最佳提取工艺条件如下：料液比为1∶30（g∶ mL），提取时间为50 min，提取次数3次，超声波功率为150 W。在此工艺条件下得豌豆蛋白提取率高达95.64%，其抗氧化活性測定结果如下：DPPH·自由基的清除率为51.5%，超氧阴离子自由基清除率为54.5%，羟自由基清除率为56.3%，还原力为0.54。因此，优化的提取工艺合理、可行，豌豆蛋白具有较强的抗氧化活性。

关键词 豌豆蛋白;超声辅酶法;提取;抗氧化活性

中图分类号 TS201.1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）13-0165-06

Abstract In order to optimize the extraction conditions of pea protein，deeply understand its physiological function and activity，and broaden the product range of pea protein，the protein from pea powder was extracted by ultrasonic coenzyme method with dried pea as the research object.The extraction conditions were optimized and the antioxidant activity of the extracted products in vitro was determined.The results of the optimum extraction conditions within the scope of experimental research were as follows：the ratio of raw material to water 1∶30（g∶ mL），extracted 50 minutes，3 times，ultrasonic power 150 W.Under those conditions，the extraction rate of pea protein was up to 95.64%.The results of antioxidant activity were as follows：the scavenging rate of pea protein to DPPH·，superoxide anion and hydroxyl radical was 51.5%，54.5% and 56.3%，respectively，and the reducing ability was 0.54.Therefore，the optimization of pea protein extraction process technology was reasonable and feasible，and pea protein had stronger antioxidant activity.

Key words Pea protein;Ultrasonicassisted enzymatic method;Extraction;Antioxidant activity

豌豆（Pisum sativum Linn，pea），别称麦豌豆、寒豆、麦豆、雪豆、毕豆、麻累、国豆、蚕豆（吴语）等，原产于地中海南部及地中海沿岸，是一种营养性食品[1]。豌豆种子富含蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、维生素和矿物质等，其中蛋白质含量达20.6%[2]，豌豆蛋白具有抗氧化、抗癌防癌、抗菌消炎和增强机体免疫力等多种生理功能[3]，在众多功能中，抗氧化作用是其发挥其他生理功能的基础。目前有关豌豆蛋白的研究多针对于理化特性，而关于其生理功能尤其是抗氧化功能的研究较少。系统地研究豌豆蛋白的抗氧化功能有助于深入挖掘豌豆蛋白的其他生理功能，并为其他生理功能的深入研究奠定基础。

目前国内外提取豌豆蛋白的方法主要有物理法（超滤膜法、超声波提取法）、化学法（盐析法、沉淀法）和生物学法（酶水解法）3种。将超声波提取技术与酶水解2种提取方法有机结合，也就实现了物理法与生物学法之间的结合，进而得到一种具有提取率高、提取时间短、工作效率高等优点的超声辅酶法。该研究采用超声辅酶法提取豌豆蛋白，设置合理的工艺条件，确定最佳工艺参数，使豌豆蛋白提取工艺得到优化，提高豌豆蛋白提取率，并测定提取产物豌豆蛋白的抗氧化活性，以期为豌豆蛋白的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 豌豆，网络购买，产于河南商丘;碱性蛋白酶购自浙江博南生物科技有限公司;考马斯亮蓝G-250购自上海远慕生物科技有限公司;牛血清蛋白购自苏州达麦迪生物医学科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自合肥巴斯夫生物科技有限公司;三羟甲基氨基甲烷和邻苯三酚购自成都市科龙化工试剂厂;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备 UV 2600型紫外可见分光光度计（上海天美科技科学仪器有限公司）;TG16W高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）;SB-5200 DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;RRH-250型高速多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）;KDN-102C凯氏定氮仪 （上海纤检仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 豌豆蛋白提取的工艺流程。干豌豆→粉碎成粉→加水混匀→加酶→调节溶液pH（酶的最适pH）→在超声波辅助提取下提取一定时间→100 ℃水浴，灭酶10 min→6 000 r/min 离心15 min→去掉上层的脂肪结块和下层沉淀→收集中间的清液→分光光度计测吸光度→计算蛋白质含量。

1.3.2 豌豆基础成分的测定。水分：常压干燥法，参照GB/T 5009.3—2016[4];蛋白质：凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5—2016[5]。

1.3.3 蛋白含量测定。

1.3.3.1 绘制标准曲线。以牛血清白蛋白为标准样品，采用考马斯亮蓝法测定其含量，以吸光度值（A）为横坐标，蛋白质浓度（μg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线[6]。

1.3.3.2 蛋白含量测定。取0.3 mL提取液于试管中，加015 mol/L氯化钠溶液定容至1 mL，加5.0 mL考马斯亮蓝溶液后摇匀，在595 nm波长下测定吸光值。与标准曲线对比，计算蛋白质含量[7]。

1.3.4 单因素试验。采用“1.3.1”方法提取蛋白质，固定提取条件为提取次数3次、提取时间50 min、超声波功率150 W，考察不同料液比对豌豆蛋白提取率的影响;固定提取条件为提取次数3次、料液比1∶30（g∶mL）、超声波功率150 W，考察不同提取时间对豌豆蛋白提取率的影响;固定提取条件为料液比1∶30、超声波功率150 W、提取时间50 min，考察提取次数对豌豆蛋白提取率的影响;固定提取条件为提取次数3次、料液比1∶30、提取时间50 min，考察超声波功率对豌豆蛋白提取率的影响。

1.3.5 响应面试验设计。在单因素试验的基础上，利用Design Expert软件的Box-Behnken试验设计原理，以豌豆蛋白提取率为响应值（Y），以料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）、超声波功率（D）为自变量，设计四因素三水平响应面分析试验，以优化豌豆蛋白提取工艺。因素与水平设计见表1。

1.3.6 抗氧化活性测定。取最佳工艺条件下制得的蛋白质提取液，测定其抗氧化活性。

1.3.6.1 DPPH·自由基清除率的测定。参考Teng等[8]的方法，并略作修改：将配成不同底物浓度的蛋白溶液2 mL和0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，立即混匀，在避光处保存30 min，以无水乙醇溶液作为参比溶液，在波长为517 nm处测定吸光度（Ai）;用无水乙醇溶液代替DPPH·溶液，测定吸光度（Aj）;用无水乙醇溶液代替豌豆蛋白溶液测定吸光度（A0）。清除率计算公式：

清除率=A0-（Ai-Aj）A0×100%（1）

1.3.6.2 超氧阴离子自由基

（O2·-）清除率的测定。采用邻苯三酚法[9]：4.5 mL Tris-HCl和3.3 mL蒸馏水混匀后，25 ℃下保持20 min后加入0.9 mL提取液和0.3 mL邻苯三酚溶液，混匀后倒入比色皿，以10 mmol/L的HCl作参比溶液，在波长为320 nm处，每30 s测定吸光度，计算4 min内平均每分钟吸光度的增加A2，并计算不加样品的对照组的吸光度A1。清除率计算公式：

清除率=A1-A2A1×100%（2）

1.3.6.3 还原力测定。参考Benzie等[10]的方法：1 mL蛋白质提取液中加入2.5 mL pH为6.6的0.2 mol/L磷酸缓冲液（PBS），50 ℃水浴20 min，快速冷却后加入2.5 mL质量分数为10%的三氯乙酸（TCA）溶液，3 000 r/min离心10 min后取上清液2.5 mL，再加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀，于10 min后以蒸馏水作为参比液，波长700 nm处测定吸光度（A），并测定不加样品的对照组的吸光度（A0）。还原力计算公式：

还原力=A-A0 （3）

1.3.6.4 羟自由基（·OH）清除率的测定。参考水杨酸法[11]，并作相应改动：蛋白质提取液1 mL，加入FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液和H2O2溶液各1 mL，37 ℃下保持30 min后离心，以蒸馏水作参比溶液，510 nm波长处测定吸光度（Ai），用蒸馏水溶液代替H2O2溶液，测定吸光度（Aj）;用蒸馏水代替提取液测定吸光度（A0）。清除率计算公式：

清除率=A0-（Ai-Aj）A0×100%（4）

1.4 数据统计分析 采用Microsoft Excel 2007、Design Expert 8.0.6软件进行数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 豌豆基礎成分的测定结果 豌豆中水分含量为912%，蛋白质含量为20.60%。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对豌豆蛋白提取率的影响。由图1可知，随着料液比的不断减小，蛋白质提取率不断增大，当料液比在1∶30时，提取率达到最大，主要是由于溶剂与样品接触面浓度差变大，引起渗透压增大，更有利于溶质的渗出，最终得到蛋白质提取率不断升高的现象[12];随后料液比减小，提取率下降，主要是由于随着料液比的不断减小，提取液中蛋白质浓度降低，增加了蛋白质的提取难度。因此，选择料液比1∶25、1∶30、1∶35进行响应面优化试验。

2.2.2 提取时间对豌豆蛋白提取率的影响。由图2可知，随着提取时间的增加，蛋白质提取率呈先上升后下降的变化趋势，在提取时间为50 min时，蛋白质提取率达到最大。主要由于提取时间增加，溶质的溶解度逐渐增大，酶与蛋白质充分反应，当达到一定时间后，溶质的溶解度达到最大，且酶活性降低，进而蛋白质的提取达到最大限度，不再溶出蛋白质[13]。因此，选择提取时间40、50、60 min进行响应面优化试验。

2.2.3 提取次数对豌豆蛋白提取率的影响。由图3可知，提取次数不同豌豆蛋白提取率不同，随着提取次数的增加，豌豆蛋白提取率呈上升趋势，当次数在1～3时，提取率上升趋势明显，之后继续增加提取次数，提取率虽有上升，但是幅度很小，这主要是由于前期已经将大部分蛋白质提取出来，后期继续提取效果已不明显，反而会增加时间和试剂的消耗，因此，选择提取2、3和4次进行响应面优化试验。

2.2.4 超声波功率对豌豆蛋白提取率的影响。由图4可知，随着超声波功率的增大，豌豆蛋白提取率先增加后下降，在超声波功率为150 W时，提取率达到最大。这是因为超声波的功率增加，其空化效应和机械效应就愈加明显，作用更加强烈，将植物细胞壁进一步破碎，增大蛋白质溶出速率，进而使蛋白质更易溶出。但超声波功率大于150 W后，超声波作用则会引起蛋白质的变性，最终会影响蛋白质提取率[14]。因此，选择超声波功率120、150和180 W进行响应面优化试验。

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计及结果。在单因素试验结果基础上，以豌豆蛋白提取率为响应值（Y），以料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）、超声波功率（D）为自变量，应用Design Expert8.0.6统计分析软件设计试验方案，结果如表2所示。

2.3.2 回归模型拟合及方差分析。利用统计软件对表2数据进行多元回归拟合，得到提取率（Y）与自变量之间的回归方程，即：

分析可知，回归模型P<0.01，表明该回归模型极显著;模型的R2=0.962 5，表明模型的拟合值与实际结果的相关性较高;失拟项不显著（P>0.05），说明回归方程拟合较好，模型稳定;变异系数CV=4.69%<10.00%，进一步說明模型拟合较好，可用来进行分析和预测。

由F可知，4个因素对响应值影响的大小顺序A>B >C>D，其中，一次项A和交互项AB，以及二次项A2、B2、C2、D2对响应值的影响极显著（P<0.01），一次项B和交互项AC、AD对响应值的影响显著（P<0.05）。

2.3.3 响应面分析。两因素之间的交互作用对响应值的影响可以通过响应面图反映出来，响应曲面坡度越陡峭，说明因素改变对于响应值的影响越大，而曲面坡度越平滑，说明因素改变对响应值的影响也就越小[15]。图5为料液比与提取时间、料液比与提取次数、料液比与超声波功率、提取时间与提取次数、提取时间与超声波功率、提取次数与超声波功率之间交互作用对豌豆蛋白提取率的影响。从图中可以看出，图5a曲面坡度最陡峭，图5b和图5c曲面坡度较陡峭，而图5d、图5e和图5f曲面坡度较平滑，说明料液比与提取时间的交互作用对豌豆蛋白提取率的影响最明显，其次是料液比与提取次数的交互作用、料液比与超声波功率的交互作用的影响，而提取时间与提取次数、提取时间与超声波功率、提取次数与超声波功率的交互作用对豌豆蛋白提取率的影响不明显，此结果与方差分析结果一致。

2.3.4 验证试验。对回归方程进行分析求解，得豌豆蛋白提取率达到最大值时的提取条件为料液比1∶30.51，提取次数3.1次，提取时间50.22 min，超声波功率150.98 W，此条件下的提取率预测值为95.04%。为方便试验操作，将提取条件定为料液比1∶30，提取次数3次，提取时间50 min，超声波功率150 W，在此条件下进行验证试验，得豌豆蛋白提取率为95.64%，预测误差为0.63%，与预测值接近。说明此模型可以用于豌豆蛋白提取条件的分析预测，响应面法也可以有效优化豌豆蛋白提取工艺条件。

2.4 抗氧化活性试验

2.4.1 DPPH·清除率测定结果。DPPH·是一种很稳定的氮中心的自由基，它的无水乙醇溶液呈紫色，在517 nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系，向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，进而可评价其清除自由基的能力[16]。豌豆蛋白提取物对DPPH·的清除能力如图6所示，由图中可以看出，DPPH·清除率呈现先上升后下降的趋势，当豌豆蛋白提取物浓度为1%～3%时，随着浓度的升高，DPPH·清除率上升，当浓度达3%时，DPPH·清除率达到最大值51.5%。之后随着浓度的下降， DPPH·清除率也下降。说明豌豆蛋白具有一定的清除DPPH·自由基的作用，且最佳清除浓度为3%。

2.4.2 超氧阴离子自由基（O2·-）清除率测定结果。O2·-在水溶液中不太活泼，但其质子化形式HOO·比较活泼，它可以启动脂质过氧化反应，并能和GSH反应。细胞膜表面的微酸性环境非常利于HOO·的生成，HOO·的穿透性很强，容易引起细胞膜深层及细胞内物质的损伤[17]。因此，通过测定O2·-的清除率可判断物质抗氧化能力的强弱。豌豆蛋白提取物对O2·-的清除率如图7所示，从图中可以看出，O2·-的清除率呈现先上升后下降的趋势。当提取物浓度为1%～3%时，O2·-清除率随提取物浓度的增加而升高，当提取物浓度达3%时，O2·-清除率达到最大值54.5%，之后当浓度为3%～5%时，清除率逐渐下降。结果表明豌豆蛋白具有一定清除O2·-的作用，且最佳清除浓度为3%。

2.4.3 还原力测定结果。由图8可知，在1%～3%内，随着浓度的增加，吸光度增大，还原力也增大，这是因为当提取物浓度增大时，和碱性蛋白酶接触并反应得更加充分，其还原力也随着提取物浓度的增大而增大，当提取物浓度为3%时，吸光度最大，即还原力最大，但在3%～5%内，提取物浓度继续增大，吸光度逐渐变小，还原力也变小，主要是因为当提取物浓度增大到一定程度时，会抑制酶促反应的进行[18]，因此，其还原力最强的浓度为3%。

2.4.4  羟自由基（·OH）测定结果。·OH是已知的氧自由基中最强的氧化剂，它可以启动脂质过氧化反应，几乎可以和所有的细胞成分发生反应，对机体的危害极大[19]。因此，通过测定物质清除·OH的能力可以判断物质抗氧化能力的强弱。由图9可以看出，豌豆蛋白提取物对·OH的清除能力随浓度增加呈先上升后下降趋势，即在浓度为1%～3%时，清除率逐渐上升，浓度达3%时，清除率达到最高点56.3%，之后当浓度为3%～5%时，清除率逐渐下降，此结果表明，豌豆蛋白具有一定的清除·OH的能力，且清除效果最佳的浓度为3%。

3 结论

该研究采用超声辅酶法从豌豆中提取豌豆蛋白，在单因素试验的基础上，应用响应面分析法优化豌豆蛋白的提取工艺，并得到豌豆蛋白提取的最佳工艺条件为料液比1∶30（g∶mL），提取次数3次，提取时间50 min，超声波功率150 W，在此条件下得豌豆蛋白提取率为95.64%，预测值为95.04%，预测误差为0.63%，说明采用响应面方法优化豌豆蛋白提取工艺可行，此结果为今后对豌豆蛋白的进一步研究奠定了理论基础。

抗氧化活性试验结果表明，豌豆蛋白具有一定的抗氧化能力，其中，对DPPH·、O2·-和·OH的最大清除率分别为51.5%、54.5%、56.3%，最大还原力为0.54，此结果可为豌豆蛋白在食品及医药保健品等领域的开发利用提供一定的借鉴。

参考文献

[1]梁晗妮，唐传核.豌豆蛋白的功能特性研究[J].现代食品科技，2012，28（12）：1640-1644.

[2] 薛园园.豌豆蛋白的酶水解及其产物抗氧化性能研究[D].郑州：河南工业大学，2011.

[3] 师伟伟，华欲飞.豌豆粉丝厂废水中蛋白质的提取和性质研究[J].食品工业科技，2014，35（1）：120-124.

[4] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中水分的测定：GB/T 5009.3—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.

[5] 国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定：GB/T 5009.5—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.

[6] 柳荫，吴凤智，陈龙，等.考马斯亮蓝法测定核桃水溶性蛋白含量的研究[J].中国酿造， 2013，32（12）：131-133.

[7] 邓丽莉，潘曉倩，生吉萍，等.考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量的条件优化[J].食品科学，2012， 33（24）：185-189.

[8] TENG D，FANG Y，SONG X Y，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis parameters for antioxidant capacity of peptide from goat placenta[J].Food and bioproducts processing，2011，89（3）：202-208.

[9] 杨文丽，杨光，杨波.纳豆多糖发酵工艺的优化及清除自由基研究[J].工业微生物，2018，48（6）： 39-45.

[10] BENZIE I F，STRAIN J J.The ferric reducing ability of plasma （FRAP） as a measure of"antioxidant power"：The FRAP assay[J].Analytical biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[11] 葛慧芳，孙明飞，叶佳，等.川芎醇提物抗氧化活性及抗食源性致病菌特性分析[J].食品工业科技，2019，40（10）：127-132.

[12] PILLAI P K S，STONE A K，GUO Q，et al.Effect of alkaline deesterified pectin on the complex coacervation with pea protein isolate under different mixing conditions [J].Food chemistry，2019，284：227-235.

[13] CHAO D F，JUNG S，ALUKO R E.Physicochemical and functional properties of high pressuretreated isolated pea protein [J].Innovative food science and emerging technologies，2018，45：179-185.

[14] 张晓云，谢玲燕，季明敏，等.超声波辅助碱法提取芡实蛋白工艺[J].食品研究与开发，2012，33（11）：96-99.

[15] CUI H，PAN H W，WANG P H，et al.Essential oils from Carex meyeriana Kunth：Optimization of hydrodistillation extraction by response surface methodology and evaluation of its antioxidant and antimicrobial activities [J].Industrial crops and products，2018，124：669-676.

[16] HA MLAOUI I，BENCHERAIET R，BENSEGUENI R，et al.Experimental and theoretical study on DPPH radical scavenging mechanism of some chalcone quinoline derivatives[J].Journal of molecular structure，2018，1156：385-389.

[17] RANJBARAN A，KAVOOSI G，MOJALLALABATABAEI Z，et al.The antioxidant activity of Trachyspermum ammi essential oil and thymol in murine macrophages[J].Biocatalysis and agricultural biotechnology，2019，20：1-7.

[18] 黄越，周春晖，黄惠华.不同提取方法猴头菇粗多糖的表征及其抗氧化活性的比较[J].食品工业科技，2017，38（3）：80-86.

[19] POWNALL T L，UDENIGWE C C，ALUKO R E.Effects of cationic property on the in vitro antioxidant activities of pea protein hydrolysate fractions [J].Food research international，2011，44（4）：1069-1074.