响应面法优化血满草多糖双水相萃取工艺

袁雷　钟政昌　刘瑜　胡潇翎　钱康

摘要 [目的]优化血满草多糖的双水相萃取工艺。[方法]通过考察K2HPO4浓度、PEG6000浓度和多糖浓度对血满草叶多糖萃取率的影响，以单因素试验结果为基础，使用响应面法对血满草多糖的双水相萃取工艺进行优化，模拟得到回归模型。[结果]血满草多糖的最佳双水相萃取工艺为K2HPO4浓度29.09%、PEG6000浓度17.07%、多糖浓度26.21 mg/mL。经验证试验，血满草多糖的实际萃取率为85.802 5%±0.739 3%，与模型预测值接近，两者相对误差为1.37%。[结论]该回归模型可真实反映萃取条件对多糖萃取率的影响，为血满草多糖的开发利用提供了重要的参考数据。

关键词 血满草;多糖;双水相体系;萃取工艺;优化;响应面法

中图分类号 R284.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）13-0179-04

Abstract [Objective] In order to optimize the aqueous twophase extraction process of polysaccharide from Sambucus adnate. [Method]The effects of K2HPO4 concentration， PEG6000 concentration and polysaccharide concentration on the extraction rate were investigated. Based on the single factor test results， the response surface method was used to optimize the aqueous twophase extraction process and a regression model was simulated. [Result]The optimal aqueous twophase extraction process of polysaccharides from Sambucus adnate was：the concentration of K2HPO4， PEG6000 and polysaccharide were 29.09%， 17.07% and 26.21 mg/mL， respectively. In the validation test， the actual extraction rate was 85.8025% ± 0.7393%， which was close to the predicted value of the model， and the relative error was 1.37%. [Conclusion]The regression model can truly reflect the influence of extraction conditions on the extraction rate of polysaccharide， and provide important reference data for the development and utilization of polysaccharide from Sambucus adnate.

Key words Sambucus adnate Wall.;Polysaccharide;Aqueous twophase extraction;Extraction process;Optimization;Response surface methodology

血滿草（Sambucus adnate Wall.）为忍冬科接骨木属植物的干燥地上部分或全草，药用全草或根皮，分布于西藏、四川、云南等省区，其味辛、甘、性温，具有祛风、利水、活血、通络的功效，主治急慢性肾炎、风湿疼痛、风疹瘙痒、脊髓灰质炎后遗症、慢性腰腿疼、扭伤瘀痛、骨折等症状[1]。血满草是我国民间常用药，在藏、傣、彝、哈尼等少数民族中有着悠久的药用历史，并被记录于各少数民族的药书中[2]。

目前，国内外对血满草化学成分及生物活性的研究有一定的研究报道，但有关血满草多糖的研究报道还很少[3]。随着对多糖的生物活性越来越深入的研究，发现多糖具有增强免疫、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性[4-7]，使多糖逐渐成为当今新药开发的重要方向之一。

双水相萃取法是一种新型萃取分离技术，它具有生物的相容性较好、提取效率高等优点[8]。目前，双水相萃取技术已经广泛地运用到各种生物有效成分的提取中，如酚类、蛋白质和多糖等[9]。孟宪军等[10]已经运用响应面法优化双水相萃取技术萃取五味子多糖，结果表明双水相萃取可以用于五味子多糖的提取。

血满草在西藏分布较广，资源量相对较大，但是利用率极低，尚未得到合理的开发利用，关于双水相萃取血满草多糖的相关研究也鲜见报道。该研究以血满草叶片为材料，采用响应面法优化血满草多糖的双水相萃取工艺，为血满草的开发利用提供参考，也为后期开展血满草多糖的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。血满草（Sambucus adnate Wall.）采自西藏自治区林芝市巴宜区觉木沟。

1.1.2 主要试剂。所有试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器。722N紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）;L-550离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）;LGJ0.5冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 血满草多糖的制备。将血满草叶片粉末分别用3倍体积石油醚和乙醇回流脱除脂溶性和醇溶性杂质;以纯水作为提取剂，在提取温度89 ℃、提取时间114 min、溶剂用量26 mL/g、提取4次条件下热水浸提血满草多糖。合并提取液，浓缩后加入无水乙醇至终浓度为80%，于4 ℃醇沉24 h，再经4 000 r/min离心10 min，取沉淀，加入少量纯水复溶，冷冻干燥得到血满草多糖。

1.2.2 血满草多糖萃取率的计算。采用硫酸苯酚法测定双水相体系中上下相的多糖浓度[11]。根据该法测定的双水相上下相多糖浓度计算多糖的萃取率。

K=Ct/Cb（1）

R=Vt/Vb（2）

Y=1/（1+RK）（3）

式中，K为多糖在双水相体系的分配系数;R为双水相体系上下相的体积比;Y为多糖的萃取率（%）;Ct为双水相体系上相多糖的浓度（g/L）;Cb为双水相体系下相多糖的浓度（g/L）;Vt为双水相体系上相体积（mL）;Vb为双水相体系下相体积（mL）。

1.2.3 单因素试验设计。设定PEG分子量、K2HPO4浓度、PEG浓度和血满草多糖浓度为因素，以多糖萃取率为考察指标，考察除PEG分子量以外的3个因素对血满草叶多糖萃取效果的影响。

1.2.3.1 PEG分子量对多糖萃取率的影响。K2HPO4浓度30%，PEG浓度15%，血满草多糖浓度为25 mg/mL，双水相体系为10 mL，分别考察PEG分子量为1 000、2 000、4 000、6 000、10 000和20 000 Da对血满草叶多糖萃取效果的影响。

1.2.3.2 K2HPO4浓度对多糖萃取率的影响。PEG6000浓度15%，血满草多糖浓度20 mg/mL，双水相体系为10 mL，分别考察K2HPO4浓度为20%、25%、30%、35%、40%和45%时对血满草叶多糖萃取率的影响。

1.2.3.3 PEG6000浓度对多糖萃取率的影响。K2HPO4浓度30%，血满草多糖浓度20 mg/mL，双水相体系为10 mL，分别考察PEG6000浓度为5%、10%、15%、20%、25%和30%对血满草叶多糖萃取率的影响。

1.2.3.4 血满草多糖浓度对多糖萃取率的影响。K2HPO4浓度30%，PEG6000浓度15%，水相体系为10 mL，分别考察血满草多糖浓度为5、10、15、20、25、30和35 mg/mL对血满草多糖萃取率的影响。

1.2.4 响应面试验设计。综合单因素试验结果，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取K2HPO4浓度、PEG6000浓度和血满草多糖浓度3个因素为自变量，每个自变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码，多糖萃取率为响应值，使用Design Expert 8.0.5软件对试验进行设计，通过响应面设计优化多糖萃取工艺，中心组合试验的因素与水平见表1。

1.3 数据处理 采用SPSS 19.0分析软件对数据进行分析。响应曲面模型的回归方程式和显著性统计用Design Expert 8.0.6.1软件进行计算和分析。

2 结果与分析

2.1 双水相体系对多糖萃取率的影响

2.1.1 PEG分子量对多糖萃取率的影响。从PEG分子量对血满草叶多糖萃取效果的影响（图1）可以看出，K2HPO4对不同分子量的PEG均有良好的分相能力，但不同分子量的PEG对血满草多糖萃取率有较大的变化，对于分子量较小的PEG来说分相能力弱于分子量较大的PEG，然而分子量过大的PEG溶液较为黏稠，不利于试验的下一步进行，根据图1，考虑多方面的因素，所以选择萃取率较高的PEG6000作为PEG-K2HPO4双水相体系的组成成分之一。

2.1.2 K2HPO4浓度对多糖萃取率的影响。从K2HPO4浓度对血满草叶多糖萃取率的影响（图2）可以看出，在一定范围内，隨着K2HPO4浓度的增加，K2HPO4浓度为35%时多糖的萃取率达到最高，随着K2HPO4浓度质量继续增加，萃取率降低。因此K2HPO4浓度取35%效果较好。

2.1.3 PEG6000浓度对多糖萃取率的影响。

从图3可以看出，在一定的范围内，随着PEG6000浓度的增加，血满草叶多糖的萃取率逐渐升高，PEG6000浓度增加至15%时，萃取率最大，随后逐渐降低，可能是因为下相浓度过高，导致上相体积减少，降低了萃取率。综合各个方面的因素，最终选择PEG6000浓度为15%。

2.1.4 多糖浓度对多糖萃取率的影响。从图4可以看出，在一定范围内，随着多糖浓度的增加，多糖萃取率增加，多糖浓度增加至25 mg/mL时萃取率最大。因此，多糖浓度为25 mg/mL为宜。

2.2 响应面试验设计

根据单因素试验结果，选取K2HPO4浓度、PEG6000浓度和多糖浓度3个因素为自变量，多糖萃取率为响应值，采用Design Expert软件进行试验设计，通过响应面试验对多糖双水相萃取工艺进行优化。响应面试验方案和试验结果见表2。

应用Design Expert软件设计响应面方案，对数据进行处理和分析，得到多糖萃取率的多元回归方程：Y=-108.142 0+6.589 7A+0.941 9B+6.962 8C-0.025 5AB+0.006 3AC+0.078 0BC- 0.108 6A2-0.065 7B2-0.161 7C2。利用Design Expert 8.0.5软件对上述多元回归模型进行方差分析及显著性统计和适合度检验，F检验结果表明模型具有极显著性（P=0.000 2）;失拟度的F值为3.099 5，P值为0.151 5>005，失拟度不显著，表明多元回归模型能准确反映3个因素对多糖萃取率的影响。调整决定系数R2Adj=0.932 4>080，说明模型相关性高，用该模型模拟真实的3因素3水平的分析是可信的。因此，该模型可用于血满草叶多糖双水相萃取工艺试验的数据分析与预测。

运用Design Expert软件模拟生成3组等高线和响应面图，见图5。从图5可以看出，血满草多糖浓度对多糖萃取率的影响最显著，表现为曲线弧度较大;PEG6000浓度和K2HPO4浓度对多糖萃取率的影响较小，表现为曲线较平缓，但是也达到了显著水平（P<0.05）。

通过Design Expert软件，血满草多糖的最优萃取工艺为K2HPO4浓度29.09%、PEG6000浓度17.07%、多糖浓度2621 mg/mL，此时多糖萃取率预测值为86999 5%。为了方便操作，最优萃取参数修正为K2HPO4浓度29%、PEG6000浓度17%、多糖浓度26 mg/mL，此时多糖萃取率预测值为86.992 2%。

为了验证模型方程是否适用，在参数修正的条件下，进行3次重复验证试验，最终得到实际多糖萃取率为85.802 5%±0.739 3%（n=3），两者相对误差为1.37%，说明通过响应面法优化得到的模型参数稳定可靠。

3 结论与讨论

响应面试验设计可在因素和响应值之间建立模型，并且可以进行拟合分析，从而筛选出的最佳参数工艺，克服了正交试验无法给出整体最佳的试验组合和响应面的缺点[12]。此外，响应面试验设计对试验的预测性较好，且响应面的三维图能更直观、方便地表达各个因素对指标的影响，在中药有效成分提取分离领域中将会越来越得到重视[13]。该试验采用PEG6000- K2HPO4双水相体系萃取血满草多糖，经响应面优化结果表明血满草多糖的最佳萃取条件为K2HPO4浓度29.09%、PEG6000浓度17.07%、多糖浓度26.21 mg/mL，此时多糖萃取率预测值为86.999 5%。为了方便操作，最优萃取参数修正为K2HPO4浓度29%、PEG6000浓度17%、多糖浓度26 mg/mL，此时多糖萃取率预测值为86.992 2%。

通过验证测试，血满草多糖萃取率实际值为85.802 5%±0.739 3%（n=3），实际值与预测值两者相对误差较小，采用的非线性拟合模型也比较接近客观的事实，说明运用响应面法优化而得到的模型参数较为准确可靠，可以用于血满草多糖的分离纯化，为血满草资源的开发利用提供了重要的参考数据。

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