虎杖苷抑制肝星状细胞增殖活化的作用和机制研究

张丽，方步武

（天津医科大学基础医学院药理学系，天津300070）

肝纤维化是慢性肝损伤引起的一种病理性伤口愈合反应，主要表现为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的过度沉积[1]。在肝纤维化发展过程中肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）是ECM的主要来源细胞[2]。核因子NF-E2 相关因子2（NFE2-related factor 2,Nrf2）是重要的转录因子，Nrf2 可促进抗氧化基因如血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）的转录，进而保护组织和细胞抵抗氧化应激[3-4]。本研究采用的虎杖苷由于具有抗氧化及保肝作用，可用于一些肝脏疾病的治疗[5-6]。但关于虎杖苷对肝星状细胞活化的影响及作用机制尚未深入研究。本研究通过体外培养HSC-T6 细胞，用不同浓度虎杖苷处理，探讨虎杖苷对肝星状细胞活化的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 本实验所用细胞是大鼠肝星状细胞HSC-T6，由北京地坛医院提供。

1.1.2 主要试剂 虎杖苷（Polydatin）购于大连美仑生物公司，Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）购于北京鼎国昌盛生物技术公司，羟脯氨酸测定试剂盒和LDH 活力测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，β-actin 抗体、α-tubulin 抗体和BCA 蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术研究所，CollagenⅠ抗体购于北京博奥森生物技术公司，α-SMA 抗体购于Cell Signaling Technology（CST），HO-1 抗体购于Abconal，Nrf2 抗体购于Pepro Tech 公司。

1.1.3 主要仪器 680 酶标仪（美国BIO-RAD 公司），CO2恒温培养箱（美国NAPCO series5400），DL-CJ-2NDI 洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造公司），WD-9405A 型脱色摇床（北京六一仪器厂），湘仪L420 低速自动平衡离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），垂直电泳槽（美国BIO-RAD 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组处理 细胞培养在含有10%FBS（Gibco，USA），50 U/mL 青霉素/链霉素的DMEM（Gibco，USA）中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中。实验分4 组：（1）对照组。（2）不同浓度虎杖苷（Polydatin）给药组：125、250、500 μmol/L。给药时间为48 h。

1.2.2 细胞活力测定 使用MTT 法测定虎杖苷对肝星状细胞增殖的影响。将HSC-T6 细胞根据实验分组以5×104个/mL 的密度接种于96 孔板中。培养24 h 后用不含血清的DMEM 饥饿12 h，然后用不同浓度的虎杖苷处理细胞。处理48h 后每孔加入20μL 0.5%MTT，继续孵育4 h，吸出废液，每孔加入200 μL DMSO 溶解产生的蓝紫色结晶甲臢（formazan），震荡10 min，490 nm 处测定每孔的吸光度值。细胞活力计算公式：细胞活力（%）=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。

1.2.3 LDH 活力测定 根据实验分组处理细胞后收集细胞培养上清液。比色法测定细胞培养液中LDH的活性，取20 μL 细胞上清液，按照LDH 活力测定试剂盒说明书进行操作，波长450 nm 酶标仪测定吸光度值。LDH 活性（U/L）=[（测定OD 值－对照OD 值）/（标准OD 值－空白OD 值）]×1 000×标准品浓度（0.2 μmol/mL）。

1.2.4 羟脯氨酸（Hyp）含量测定 根据实验分组处理细胞后收集细胞培养上清液。酶消化法测定细胞培养液中Hyp 的含量，取500 μL 细胞上清液，根据Hyp 测定试剂盒说明书进行操作，波长550 nm 处，1 cm 光径，双蒸水调零，测定各管吸光度。羟脯氨酸含量（μg/mL）=[（测定OD 值－空白OD 值）/（标准OD 值－空白OD 值）]×标准品浓度（5 μg/mL）。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测Ⅰ型胶原（collagenⅠ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Nrf2 和HO-1 蛋白的表达 按照实验分组，将HSC-T6 细胞以5×104个/mL 密度接种于6 孔板中，培养24 h 后用不含血清的DMEM 饥饿12 h，然后用不同浓度虎杖苷处理细胞48 h。药物处理后，弃去培养液，每孔加入适量含有1%PMSF 的RIPA 裂解液来提取蛋白并用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，取等量蛋白SDS-PAGE 电泳分离后转移到PVDF 膜上，使用5%脱脂牛奶阻断非特异性蛋白结合，4℃下孵育一抗（collagenⅠ1:500、α-SMA 1:1 000、Nrf2 1:1 000、HO-1 1:1 000）过夜。次日，TBST 洗膜3 次，每次7 min，HRP 结合二抗（1:1 000）室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次后，ECL 化学发光试剂盒显色，采用Image J 软件对蛋白条带的光密度值进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计分析软件，所有符合正态分布的计量资料以(±s 表示。多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐则采用LSD检验，若方差不齐采用Dunnett T3检验。以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虎杖苷对细胞增殖的影响 如图1 所示，与对照组比较，不同浓度的虎杖苷（125、250、500 μmol/L）作用于HSC-T6 细胞48 h后，对HSC-T6 细胞增殖有明显的抑制作用（F=252.01，P＜0.001）；与虎杖苷125 μmol/L 组比较，虎杖苷250、500 μmol/L组中细胞活力显著降低（F=252.01，P＜0.001）；与虎杖苷250 μmol/L 组比较，虎杖苷500 μmol/L 组中细胞活力显著降低（F=252.01，P＜0.001）。

2.2 虎杖苷对LDH 活力的影响 与对照组（80.34±13.61）U/L 比较，虎杖苷125、250、500 μmol/L 组中LDH 活性无明显变化[（84.83±8.71）、（82.91±12.26）、（79.91±10.28）U/L]，如图2 所示，差异无统计学意义（F=0.246，P＞0.05）。

2.3 虎杖苷对Hyp 含量的影响 如图3 所示，与对照组[（2.91±0.18）μg/mL]比较，虎杖苷125、250、500μmol/L组中Hyp 含量显著降低[（2.61±0.13）、（2.29±0.13）、（2.05±0.19）μg/mL；F=16.50，P＜0.05]；与虎杖苷125 μmol/L 组比较，虎杖苷250、500 μmol/L 组Hyp 含量显著减少（F=16.50，P＜0.05），且随着浓度的增高，抑制作用越明显，呈一定的剂量依赖性。

图1 虎杖苷对细胞增殖的影响（±SD,n=6）Fig 1 Effects of Polydatin on the proliferation of cell(±SD,n=6)

图2 虎杖苷对LDH 活力的影响（±SD,n=6）Fig 2 Effects of Polydatin on the activity of LDH(±SD,n=6)

图3 虎杖苷对Hyp 含量的影响（±SD,n=9）Fig 3 Effects of Polydatin on the content of Hyp(±SD,n=9)

2.4 虎杖苷对α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达的影响 如图4 所示，与对照组比较，虎杖苷125、250、500 μmol/L组中α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表达水平显著降低（F=19.89，P＜0.05；F=182.91，P＜0.001）；与虎杖苷125 μmol/L 组比较，虎杖苷250、500 μmol/L 组中α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表达水平显著降低（F=19.89，P＜0.05；F=182.91，P＜0.001），随着剂量增大，抑制作用越明显，表现出一定的剂量依赖性。

图4 虎杖苷对α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表达的影响（±SD,n=3）Fig 4 Effects of Polydatin on the protein expression of α-SMA and CollagenⅠ(±SD,n=3)

2.5 虎杖苷对Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响 如图5 所示，与对照组比较，虎杖苷125、250、500 μmol/L组中Nrf2 蛋白表达水平显著升高（F=23.70，P＜0.05），虎杖苷250、500 μmol/L 组中HO-1 蛋白表达水平显著增加（F=12.40，P＜0.01）；与虎杖苷125 μmol/L 组比较，虎杖苷250、500 μmol/L 组中Nrf2和HO-1 蛋白表达水平显著升高（F=23.70，P＜0.05；F=12.40，P＜0.05），随着剂量增大，上调作用越明显，表现出一定的剂量依赖性。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤引起的一种病理性伤口愈合反应，随着病程的发展将导致肝硬化，最终导致肝衰竭或肝癌[7]。在肝纤维化阶段逆转其进展是治疗慢性肝病，避免肝功能衰竭的有效策略。

图5 虎杖苷对Nrf2 和HO-1 蛋白表达的影响（±SD,n=3）Fig 5 Effects of Polydatin on the protein expression of Nrf2 andHO-1（±SD,n=3）

HSCs 的活化是导致肝纤维化的重要因素[8]。活化的HSCs 表达α-SMA，合成成纤维细胞因子并促进胶原（如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅳ型胶原）的产生从而加速肝纤维化的进程。当在体外培养时，HSCs 会发生自发激活[9]。本研究发现虎杖苷处理HSC-T6细胞能抑制细胞增殖，降低细胞培养液中Hyp 的含量并下调α-SMA 及CollagenⅠ蛋白的表达。其中Hyp 是一种几乎只存在于胶原蛋白中的氨基酸，被作为衡量肝纤维化的指标[10]。由此可得，虎杖苷可以抑制HSC-T6 细胞的活化及胶原的产生，在体外具有抑制肝纤维发生的作用。

Nrf2/HO-1 可以减轻肝脏炎症、减缓肝纤维化的发展[11-12]。诱导HO-1 的表达可以抑制HSCs 增殖，降低CollagenⅠ的产生，减轻肝脏氧化应激水平，进而抑制肝纤维化的发生、发展[13]。本实验采用的虎杖苷是从虎杖根中提取的有效成分，由于具有抗氧化作用在一些肝脏疾病的防治中具有重要作用[14-17]。本研究使用不同浓度的虎杖苷处理HSC-T6 细胞，结果表明，随着虎杖苷浓度增加，Nrf2、HO-1 蛋白表达逐渐增加。

本研究发现，虎杖苷通过抑制肝星状细胞活化及胶原的产生，发挥抑制肝纤维化发生的作用，其作用机制可能与上调Nrf2/HO-1 信号通路有关，这为虎杖苷在肝纤维化治疗中应用提供了新的思路。