绿豆皮中黄酮树脂纯化条件优化及纯化物分析

康维良 ，张东杰 ，翟爱华 ， 王 霞

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319）

绿豆为一年生双子叶植物的胚，具有极高的食用和药用价值[1-2]。绿豆皮一般被加工成饲料，而较少开发其营养价值和药用价值[3-4]。绿豆皮占绿豆总质量的7%～10%。植物化学研究表明，绿豆皮中含有丰富的黄酮类化合物、喹诺利嗪类生物碱[5-6]、芳基苯并呋喃类等化合物。

近年来药理研究表明，绿豆皮总黄酮是重要的活性成分，且有抗氧化、消炎、降糖等作用，在营养配餐食品中应用的越来越广泛。但黄酮类粗提取物中普遍含有萜类、多糖、蛋白质、木脂素等多种杂质，严重制约了黄酮类化合物的实际应用[7-8]。因此，开发一种从绿豆皮中提取高纯度黄酮类化合物的有效方法是十分必要的。当前有许多草本植物黄酮类化合物的净化处理方法被开发出来，如孙曼曼[9]采用酶解耦合双水液液萃取方式纯化菟丝子黄酮最终转化率达到99%以上。侯红瑞等人[10]应用制备色谱技术纯化高良姜中黄酮单体化合物，经核磁和质谱的定性分析，纯化效果均达到70%。蒋红等人[11]选用凝胶法提纯藜蒿中的黄酮化合物，经后期定性定量分析，纯化效果均达到预期要求。以上纯化方法由于提纯过程中消耗大量有机溶剂、复杂的操作和稳定性差，分离填料及设备重复利用率低，难以应用到大批量活性物质的纯化工作中。而大孔树脂是一种高效、低成本、环保、成熟的技术，能够满足工业生产和无害化生产的需要，被广泛用于多种活性成分的富集[12-13]，目前树脂纯化技术应用较为广泛，但多作为黄酮、多糖等天然产物进一步分析其结构及组成的前处理手段。现阶段欠缺对树脂纯化后黄酮纯度提高对应的微观结构变化研究，而确定纯化后黄酮的微观结构变化对通过改变微观结构而提高黄酮纯度的研究提供一个新的途径。

拟对粗提黄酮类混合物，以AB-8型树脂为吸附分离纯化材料，以单因素确定的纯化条件为基础，通过正交试验优化，再通过改进吸附和洗脱的技术参数，获得纯化较高的黄酮类物质；最后通过红外光谱和扫描电镜，辨别纯化后的黄酮特征曲线及纯化前后黄酮的微观结构变化，以期获得经超声微波热法提取黄酮的最佳树脂纯化条件，并探究黄酮微观结构改变对黄酮纯化效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

绿豆皮提取液粗品，实验室自制；无水乙醇，分析纯，河北百胜化学制剂有限公司提供；芦丁，分析纯，北京巨邦植物原料有限公司提供；AB-8型大孔吸附树脂，粒径范围0.30～1.25 mm广东合威新材料有限公司。

1.1.2 设备

UVZ752型紫外分光光度计，北京东启产品；FD-1A-5型冷冻干燥机，江苏天翎仪器产品；RE-301型旋转蒸发器，巩义瑞德仪器产品；TG16-II型离心机，湖南平凡科技产品；FTIR-850型傅里叶变换红外光谱仪，天津港东产品；SU7000型扫描电镜，日本日立公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 试验样液的制备

根据前期试验，以优化确定的乙醇体积分数61%，料液比1∶31.4（g∶mL），时间25.8 min，微波功率521 W的超声-微波协同萃取条件，获得的黄酮粗提物，经旋转蒸发器浓缩，置于-50℃冻干机冻干后测定纯度为29.35%，备用。

1.2.2 芦丁标准曲线-芦丁的建立

以亚硝酸钠-硝酸铝反应法作为测定依据，将光度仪波长设定为510 nm，和空白试剂进行对比，确定吸光度值，创建平面直角坐标系，确定回归方程[14]。

1.2.3 树脂动态吸附平衡试验

称取处理完全的树脂，按照径高比1∶10，湿法上柱，上样条件为黄酮样液质量浓度1 mg/mL，流速2 mL/min，pH值5；洗脱条件为洗脱液95%乙醇，流速2.5 BV/h；以10 mL为基础采集1管洗脱液，测其总黄酮质量浓度，绘制动态吸附泄漏曲线。

1.2.4 计算公式

式中：C——黄酮的质量浓度，mg/mL；

C0——吸附前样液质量浓度，mg/mL；

C1——吸附后样液质量浓度，mg/mL。

V0——上柱前液体体积，mL；

V1——上柱后液体体积，mL；

M——使用树脂质量[15]。

1.2.5 单因素试验筛选树脂吸附工艺参数

（1） 最佳样液质量浓度的筛选。固定吸附的pH值4，以2 mL/min的速度，径高比为1∶10的树脂层析柱中，以质量浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mg/mL为变量，依据附着量筛选出最佳样液质量浓度。

（2）最佳流速的筛选。固定树脂吸附的质量浓度为1.5 mg/mL黄酮样液，pH值4，以1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min流速为变量，注入径高比为1∶10的树脂层析柱中，依据附着量筛选取出最佳样液流速。

（4） 最佳pH值的筛选。将质量浓度为1.5 mg/mL，pH值为3.5，4，4.5，5，5.5的样液以2 mL/min的速度，径高比为1∶10的树脂层析柱中，依据附着量筛选出最佳样液pH值。

（5） 最佳径高比筛选。将质量浓度为1.5 mg/mL，pH值为4的样液，以流速为2 mL/min的速度分别注入径高比为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25的树脂层析柱中，依据附着量筛选取出最佳树脂径高比。

1.2.6 正交试验优化吸附工艺试验

以单因素确定的树脂最高吸附量的条件样液质量浓度、流速、pH值、树脂径高比为基础水平，通过正交试验结果，经显著性分析，对树脂吸附效果进行优化，并对条件进行验证试验。

1.2.7 解析工艺条件筛选及洗脱曲线绘制

解析液质量浓度及使用量的改进，将完成动态吸附的树脂分别用150 mL体积分数为25%，35%，45%，55%，65%，75%，85%，95%进行解析，确定最佳解析液体积分数。将树脂分别用50，100，150，200，250，300 mL体积分数为55%进行解析，确定最佳解析液体积分数。参照1.2.6，1.2.7优化参数，每10 mL采集1管洗脱液，建立以总黄酮质量浓度（mg/mL） 与洗脱体积（BV） 洗脱曲线关系。

1.2.8 傅立叶变换红外吸收光谱分析

纯化液按1.2.1方法冻干后将样品准确称量1 mg，与烘干的KBr混合研磨均匀后，压片，采用FTIR红外光谱仪进行红外光谱透射法进行扫描。扫描条件参照文献[16]。

1.2.9 扫描电镜

取干燥样品2 g，喷金1 min，后移动样品台以观察干燥后的绿豆皮黄酮粗提物和经AB-8型大孔树脂纯化后的样品显微结构。扫描电镜放大倍数分别为 1 000，2 000，5 000倍，选取清晰完整的图片进行分析[17-18]。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

建立平面直角坐标系，其中横、纵轴分别代表芦丁质量浓度以及吸光度，完成线性回归后，绘制标准曲线，得到回归方程：R=10.386X-0.015 9，R2=0.998。

芦丁标准曲线见图1。

2.2 动态泄露吸附曲线

树脂动态泄露曲线见图2。

由图2可知，流出液体积60 mL时达到动态平衡，出现泄露现象此时流出液中黄酮类化合物质量浓度为0.13 mg/mL。当流出液体积达到85 mL时，为大孔吸附树脂的泄露点，流出液体积达到120 mL时，绿豆皮总黄酮质量浓度已非常接近原料液中绿豆皮总黄酮的质量浓度，说明此时AB-8型大孔树脂已趋于饱和吸附，最大上样量不能超过120 mL。

2.3 单因素试验筛选结果

2.3.1 最佳样液质量浓度的筛选

样液质量浓度与树脂吸附量的关系见图3。

由图3可知，吸附量随样品质量浓度上升呈先升高后回落的状态，在样液质量浓度为1 mg/mL时树脂吸附量达到最大值为17.31 mg/g，后吸附量随质量浓度提高而降低。这是因为提取液中含有一定杂质，质量浓度超过一定值后，杂质含量增多，堵塞在树脂空隙，减小了树脂与纯化液接触的比表面，影响树脂吸附效果。杂质的积累也会造成树脂的机械强度下降，增加流体阻力，阻碍树脂再生和重复利用。当样液质量浓度未达到平衡点前，由于树脂的多孔隙结构的吸附特性的存在，当纯化液中黄酮类物质的含量上升时，吸附量也随之增大[19]。因此选择最佳质量浓度为1 mg/mL。

2.3.2 最佳流速的筛选

样液流速与吸附量的关系见图4。

由图4可知，树脂吸附量是随着流速的升高而逐渐下降。这是因为随流速的升高，大孔树脂与黄酮样液接触时间也随之减少，黄酮类物质不能完全被吸附上。当上样流速过慢，目标物与树脂接触越充分，从而提高大孔树脂的吸附量，但会降低吸附效率[20]，因此在不影响吸附效率的情况下选取适宜的上样流速十分重要。由图4可知，树脂吸附量在流速为1 mL/min时树脂吸附量达到最大值，但由于该流速下试验周期太长，为最佳吸附流速。故选择吸附量相近的1.5 mL/min。

2.3.3 最佳pH值的筛选

pH值与吸附量的关系见图5。

由图5可知，树脂吸附量随pH值上升而升高，pH值达到5时吸附量达到最大值为17.54 mg/g，这是由于黄酮类化合物在偏酸性条件下黄酮分解酶被抑制，黄酮类化合物多数为游离状态，易被具有氢键受体特性的树脂所截获[21]。偏酸性环境还可以提高树脂的键合能力和亲脂键、偶极离子结合能力，提升吸附效果。但随着pH值上升，黄酮类物质的结构则会发生改变，转化为盐类物质，阻碍树脂吸附。故选择最适pH值为5。

2.3.4 最佳径高比的筛选

层析柱的径高比与吸附量的关系见图6。

由图6可知，大孔树脂径高比和吸附量有着极佳的线性关系，随着树脂径高比的提高，黄酮吸附量液随之增加。因为吸附量与吸附面积呈正相关，想要获取高的吸附量，则应选择径高比大的吸附参数[22]。从节省材料和最适吸附率角度考虑，在径高比为1∶20时接近最大吸附量，但考虑试验周期及可行性。选择径高比1∶15为最佳径高比，这是因为随着树脂径高比的增加，黄酮溶液与树脂的吸附面积增大，吸附的更加充分。

2.4 正交试验法改良AB-8型大孔树脂动态吸附工艺技术

考虑到不同因素彼此间存在一定的影响，为了准确找到最佳工艺条件。接下来针对样液质量浓度、流速、pH值、径高比这4个因素进行L9（34）正交试验。正交设计及结果见表1。

表1 正交设计及结果

由表1可知，最佳组合条件为A2B2C2D3，即是样液质量浓度1 mg/mL，流速为2 mL/min，pH值为5，径高比为1∶15，优化后树脂吸附量达到24.38 mg/g。按照因素和提取率关联性从高到低排序依次是样液质量浓度＞径高比＞流速＞pH值，由此可见，对提取率影响最突出的因素为样液质量浓度。

纯化条件方差分析见表2，不同样液质量浓度多重比较（LSD）见表3，不同样液质量浓度多重比较（邓肯） 见表4。

表2 纯化条件方差分析

表3 不同样液质量浓度多重比较（LSD）

方差及多重比较分析结果表明，样液质量浓度的处理因素间F值差异显著（sig=0.024＜0.05），说明样液质量浓度对黄酮吸附量有显著影响。其他各因素的F值差异不显著（sig＞0.05），说明样液质量浓度是最重要的控制条件。通过进一步对显著性因素样液质量浓度通过LSD检验法进行多重比较，优化最佳的样液质量浓度参数。由多重比较结果可知，A2（1 mg/mL） 与A1（0.5 mg/mL） 水平间差异显著，A3（1.5 mg/mL） 与A2（1 mg/mL）、A1（0.5 mg/mL）间都不存在显著性。因此，通过对显著性因素样液质量浓度水平间的多重比较，最终的纯化条件组合还是A2B1C2D3。

表4 不同样液质量浓度多重比较（邓肯）

2.5 最优解析技术筛选

吸附树脂解析过程中，解析液的质量浓度和添加量是影响解析效果的重要因素，故试验对上述2个因素分别进行单因素优化，以期筛选出最佳的解析条件[23]。

乙醇体积分数和使用量与解析率的关系见图7。

由图7可知，树脂解析率随解析液质量浓度和用量的增多而提高，通过单因素试验筛选及试验便利方面考虑最佳乙醇质量分数为95%，洗脱剂解析液最佳用量为170 mL。这是因为根据极性溶剂相似相溶原理，随着洗脱剂解析液质量分数的提高，溶剂的极性随着降低，黄酮也更易被洗脱解析下来。乙醇体积的增加则会提高树脂振荡解析过程中树脂与乙醇的接触效果，使洗脱解析更充分。

2.6 动态洗脱试验

洗脱曲线见图8。

动态洗脱试验是确定解析液用量的关键步骤，适量的解析液可以达到节省试剂和缩短试验周期的目的。由图8可知，洗脱剂用量为23 mL时，黄酮就被洗脱下来，当洗脱剂用量达到16 mL，黄酮洗脱量达到峰值；当洗脱剂用量24 mL，树脂所吸附的黄酮基本被洗脱下了。洗脱曲线峰型尖锐峰面积小，无拖尾现象说明黄酮类物质洗脱集中，洗脱效果佳，经最优条件纯化后的黄酮纯度为72.38%。

2.7 傅立叶变换红外吸收光谱分析

通过傅里叶变化光谱对绿豆皮纯化液进行定性分析，确定纯化液中的活性物质为黄酮类化合物。

FTIR扫描图见图9。

由图9可知，通过大孔树脂AB-8型纯化的绿豆皮黄酮经红外光谱扫描具有了黄酮类物质的特征官能团：在波数3 386 cm-1处的吸收峰证实了羟基的存在。根据苯环的不饱和性质进一步分析谱图波数2 926 cm-1处，可知在苯环交替处产生了C-H，为亚甲基伸缩振动峰；波数1 613 cm-1是由于芳酮羰基伸缩振动所引起的特征吸收峰，为黄酮类化合物官能团C=O；波数1 613、1 517 cm-1和1 448 cm-1为苯环中的C=C振动特征吸收峰；波数1 200～1 050 cm-1的吸收峰为酚羟基的C-O特征峰；波数837 cm-1为芳香环中的振动特征吸收峰，依据酮基结构分析可知为酮基邻位不饱和碳构成C=C-H，根据以上特征峰和分析可知，本试验纯化物分子式为C15H9O2为黄酮类化合物母环[24]。

2.8 扫描电镜

纯化前后扫描电镜图见图10。

由红外光谱试验，可知该纯化物为黄酮类化合物。从图10可知纯化前的黄酮提取物中呈片状和颗粒状，但仍有大量物质被包裹，黏附在一起。经树脂纯化后的黄酮类化合物微观结构多呈棉絮状，大量颗粒物质被释放[25]。绿豆皮经超声、微波的穿透和空化的形成了微波场生物效应和热效应，促进绿豆皮内分子间的挤压、碰撞，从而使片状包裹黄酮呈絮状释放，与学者李侠双酶法提取黄酮的纯化物比较更高的提取温度使包裹黄酮的片状结构充分打开，更多黄酮大量释放，微波和超声的协同作用也大大提高了分子间相互作用，使黄酮在电镜下呈现大簇的棉絮状，结合相关报道验证这可能是黄酮纯度提升的主要因素之一。

3 结论

通过正交试验优化的AB-8型大孔吸附树脂纯化绿豆黄酮的最佳工艺条件是样液质量浓度为1 mg/mL，流速为2 mL/min，pH值为5，径高比为1∶15，此时树脂吸附量达到最大值为24.38 mg/g，较优化前纯度提高44.03%。通过傅里叶近红外光谱对纯化物进行了定性鉴定，确定为黄酮类化合物；使用扫描电镜从微观结构确定了黄酮纯度提高的原因主要是包裹黄酮的片状结构被打开。试验以树脂吸附和解析相结合的方式研究了纯化工艺参数的优化方式，完善了大孔吸附树脂动态解析和吸附的工艺参数，为提高树脂工业化纯化效果提供了理论支持。