医院重症监护病区肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药性及其耐药基因分析

陈 娜， 张峰波， 周鹏鹏， 季 萍

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE），特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CR-KP）在临床分离株中检出率逐年增高，造成患者严重的感染和更高的病死率[1]。我国 CHINET 细菌耐药性监测数据显示，CR-KP流行存在明显的地域性差异。有报道，产碳青霉烯酶菌株的克隆传播是一些地区肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的重要原因[2]。因编码碳青霉烯酶的基因可位于基因组（染色体）的DNA上，也可位于质粒上，并可通过质粒进行水平转移，因此在同一医院的同一病区更易发生CR-KP的克隆传播。为了解新疆医科大学第一附属医院重症监护病区（ICU）肺炎克雷伯菌的耐药性特征以及有无CR-KP克隆株的传播，为其感染控制及合理应用抗菌药物提供依据，本研究回顾性收集和分析了2014－2018年分离自ICU住院患者的肺炎克雷伯菌及耐药性监测数据，并对2018年5－7月呼吸ICU（RICU）8例患者送检标本中分离的12株CR-KP及其环境中分离的3株CR-KP菌株进行耐药基因与同源性分析研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病史资料、菌株来源 患者病史资料源自于医院的电子病历系统。收集2014－2018年我院微生物室分离自ICU住院患者送检的临床标本中的肺炎克雷伯菌1 580株（剔除同一患者的重复菌株），临床主要标本中痰液占82.0%、尿液占5.4%、引流液占4.3%和血液占3.9%。其中2018年5－7月自RICU 8例患者送检标本中分离出12株CR- KP、环境中分离出3株CR-KP。本研究质控菌株有肺炎克雷伯菌 ATCC 700603、ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706。

1.1.2 试剂与仪器 全自动细菌鉴定仪 VITEK 2-Compact 60购自法国生物梅里埃公司；VITEK 2 AST-GN09、VITEK 2 AST-GN16卡、MH培养基购自法国生物梅里埃公司；纸片扩散法（K-B）亚胺培南、美罗培南药敏纸片购自英国OXOID公司或美国BBL公司；限制性内切酶Xba I、Taq酶、高保真Taq酶、dNTP和DNA分子量标志物购自TaKaRa公司；脉冲场凝胶电泳（PFGE）DNA Marker 购于Pharmacia Biotech 公司；限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、低熔点琼脂糖、高密度琼脂糖、苯甲基磺酰氟（PMSF）、琼脂糖、无水氯化钙、溴化乙锭、溴酚蓝等分子生物学试剂购于上海Sangon公司，PCR扩增仪购于PE公司；CHEF Mapper XA型PFGE、核酸电泳仪及紫外线凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品；恒温水平摇床及杂交炉为美国Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性试验 用VITEK2 全自动微生物分析仪和常规方法进行菌种鉴定和药敏试验，选择的抗菌药物包括哌拉西林、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、甲氧苄啶-磺胺甲唑。 对2018年5－7月RICU 8例患者送检标本中分离的12株CR-KP及环境中分离的3株CR-KP菌株采用肉汤微量稀释法对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、替加环素等进行药敏试验；同时采用琼脂稀释法，增加头孢他啶-阿维巴坦和磷霉素的药敏试验。药敏结果参照2018年版美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准判读。WHONET 5.6软件统计分析耐药率。

1.2.2 耐药基因的检测和分子流行病学研究

1.2.2.1 PCR扩增 本次研究的耐药基因有：blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1、8、9、blaKPC-2、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaOXA-23、48。反应体系[3]：P1和P2分别加入1 μL，MIX（含Mg2+，dNTP，TaqDNA聚合酶）12.5 μL；蒸馏水10.5 μL；DNA模板打孔加入。PCR扩增条件，95 ℃预变性5 min，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后用Bio-Rad 凝胶成像仪检测成像，阳性扩增产物进行测序分析。引物参考既往合成特异性引物[4-5]。

1.2.2.2 PFGE同源性分析 对CR-KP进行PFGE同源性分析[6]：以XbaⅠ作为核酸内切酶，37 ℃酶切5～8 h；PFGE条件为0.5×TBE、14 ℃、6 V/cm电压、120°电场夹角、电流转换时间5～35 s、电泳22 h。用沙门菌H9812作为电泳结果对照。采用BioNumerics软件对PFGE条带进行聚类分析。

1.2.2.3 多位点序列分型（MLST） 参照 MLST专业网站，即https：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html，设计gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB7对管家基因的引物，退火温度均为50 ℃[6]，对PCR扩增阳性的产物送往杭州铂尚测序公司进行测序分析，测序结果在肺炎克雷伯菌MLST数据库中进行BLAST比对，确定其序列型（ST型）。

1.2.3 相关定义 呼吸衰竭好转标准：临床症状好转，血气测定值改善；肺炎好转标准：体温正常，症状明显减轻，胸部X线检查肺部病变吸收好转；肠梗阻好转标准[7]：症状体征改善明显，X线提示肠梗阻基本解除；治疗无效：症状体征未见改善，患者家属放弃治疗。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌的耐药性及变迁

2.1.1 肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率 五年间我院ICU共检出肺炎克雷伯菌1 580株，标本来源主要为痰液（82.0%，1 296/1 580）、尿液（5.4%，86/1 580）、引流液（4.4%，69/1 580）和血液（3.9%，62/1 580）。1 580株肺炎克雷伯菌药敏试验结果显示，菌株对临床常用抗菌药物表现为不同程度的耐药。2018年439株肺炎克雷伯菌中， ESBL的检出率37.1%，对第三、第四代头孢菌素的耐药率为26.0%～37.1%、对哌拉西林-他唑巴坦的耐药率17.8%，对碳青霉烯类抗生素的耐药率为17.1%～19.0%，对庆大霉素和阿米卡星的耐药分别为27.2%和11.6%。五年间对临床常用抗菌药物的耐药率整体亦呈上升趋势，其中亚胺培南、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦耐药率分别从2014年的0.9%、1.1%、2.3%上升至2018年的17.1%、19.0%、17.8%。见表1。五年间CR-KP检出率分别为3.6%、8.1% 、8.0%、8.4%和18.7%，显示呈上升趋势。

表1 2014－2018年分离自重症监护病区肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 1 Susceptibility profiles of the Klebsiella pneumoniae strains isolated from intensive care unit from 2014 to 2018（%）

2.1.2 ICU CR-KP的检出率 2014－2018年ICU共检出165株CR-KP，其中以RICU检出率最高（92株，55.8%）。标本类型前4位为：痰液（70.0%）、尿液（11.0%）、支气管吸出物（9.0%）、血液（4.0%）。检出率总体呈上升趋势，五年间每年的检出率分别为3.6%（8/222）、8.1%（22/273）、8.0%（20/251）、8.4%（33/395）、18.7%（82/439）。

2.2 CR-KP感染患者的临床特征、耐药性及同源 性

2.2.1 CR-KP感染患者的临床特征 2018年5－7月从RICU 8例患者送检的标本中分离出12株CRKP，其中1号患者为肺部感染、呼吸衰竭、不完全肠梗阻、腹膜炎，先从痰液、腹水标本中分别分离出CR-KP，后继发血流感染，相继从血液和胆汁中分离出CR-KP；2号、5号患者为Ⅰ型呼吸衰竭、肺部感染，分别从尿中分离出CR-KP；3号、4号、6号、8号为重症肺炎、Ⅰ型呼吸衰竭，均从痰液中分离出CR-KP；7号患者为十二指肠恶性肿瘤、肠梗阻、感染性休克，先从引流液中分离出CR-KP，后继发血流感染从血液中分离出CRKP。环境中的3株CR-KP是从1号患者的ICU单间的呼吸机表面、其左侧床扶手以及责任护士的手指指腹分离到的。 8例CR-KP感染患者的临床信息见表2。

表2 8例CR-KP感染患者临床信息Table 2 Clinical data of 8 patients infected with carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in respiratory intensive care unit

2.2.2 肺炎克雷伯菌的耐药谱及分子生物学特征 2018年5－7月RICU 8例住院患者分离获得的12株CR-KP和3株与1号患者相关的环境中分离得的CR-KP共15株。对其进行耐药性及同源性分析，结果显示15株CR-KP对3种碳青霉烯类、哌拉西林-他唑巴坦等β内酰胺类、喹诺酮类、甲氧苄啶-磺胺甲唑、阿米卡星、磷霉素等抗菌药物均呈高度耐药；其中分离自患者的CR-KP各有1株对替加环素和头孢他啶-阿维巴坦耐药。耐药基因检测结果显示15株CR-KP菌株均携带编码KPC-2型碳青霉烯酶基因， MLST结果显示15株CR-KP菌株均为ST11型。PFGE结果显示15株CR-KP分别属于A～H 8个不同的型别，聚类分析结果显示菌株之间相似度低，仅2、3株菌可聚为一簇，提示菌株间的同源性较低，菌株的遗传背景差异较大。见表 3。

表3 RICU 15株肺炎克雷伯菌的耐药谱及分子生物学特征Table 3 Profiles of the 15 strains of Klebsiella pneumoniae isolated from respiratory intensive care unit

3 讨论

近年来，CRE在世界范围内呈逐年增多趋势，WHO将其列为最具威胁人类健康的“超级细菌”[8]，可使临床抗感染治疗面临巨大的挑战，对全球公众健康构成严重威胁，形势不容乐观。

肺炎克雷伯菌是引起呼吸道感染最常见的病原菌之一，本研究发现ICU肺炎克雷伯菌检出者存在呼吸系统感染症状的患者所占比例最高，因此规范化采集痰液标本，提高痰标本合格率尤为重要。2014－2018年我院ICU共检出肺炎克雷伯菌1 580株，药敏试验结果显示，肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的耐药率总体呈上升趋势，亚胺培南、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦耐药率分别从2014年的0.9%、1.1%、2.3%上升至2018年的17.1%、19.0%、17.8%。五年间CR-KP检出率从2014年的3.6%上升至2018年的18.7%，2018年CR-KP的检出率明显高于前两年。因此，动态观察肺炎克雷伯菌耐药性及CR-KP的检出率，有助于为医院感控和临床合理用药提供依据。

本组资料显示2018年5－7月短时间内自RICU分离到的15株CR-KP的耐药谱完全一致、均携带KPC-2型碳青霉烯酶耐药基因、且均为ST11型，但PFGE聚类呈散在性分布。分析其中的1号患者在感染的不同时期和不同标本中分离获得的4株CR-KP 与该患者使用的呼吸机、床扶手以及参与护理的护士手指指腹分离的3株CR-KP菌株除PFGE显示不聚类外其余特征均一致，并与其他同病区患者分离的CR-KP的特征亦一致。PFGE分析发现这些菌株无集中性的大簇聚类，仅2、3株菌可聚为一簇，提示菌株间的同源性较低，克隆呈散在分布。MLST显示这些菌株均为ST11型，同国内、国外大多报道相一致。值得注意的是，耐药谱分析显示出1株携带KPC-2、TEM、SHV、CTXM-8型耐药基因的109号菌株对头孢他啶-阿维巴坦耐药，该菌碳青霉烯酶表型试验提示不携带金属酶，是否携带其他耐药基因需行进一步研究。

我国既往报道过1种携带KPC-2的碳青霉烯类耐药的高毒力ST11型肺炎克雷伯菌（HV-CRKP）克隆株[9]，以及ST11型碳青霉烯类耐药高黏液型肺炎克雷伯菌（HKFK）的播散[10]。本研究结果显示，1号患者住院环境中分离的3株CR-KP菌株与患者分离菌株的药敏试验结果一致，除对替加环素、头孢他啶-阿维巴坦敏感，对亚胺培南、美罗培南、厄他培南 、阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、磷霉素等抗菌药物高度耐药；其耐药基因型、ST分型相一致，PFGE分别为3个不同的型别。回顾本研究1号患者的临床资料：68岁男性，初步诊断“肺部感染、呼吸衰竭、不完全性肠梗阻、腹膜炎”，入院后从痰液、腹水标本中分别分离出CR-KP，后继发血流感染，相继从血液和胆汁中又分别分离出CR-KP。随后随机对其环境进行多点采样分析，在患者所使用的呼吸机表面、患者左侧床扶手以及责任护士的手指指腹分离到CR-KP。本研究已无法判断CR-KP的传播模式，是已感染CR-KP患者在手术期间未能做好感控传播至护理人员，亦或是护理人员在操作过程中未按感控要求操作感染患者。但本研究结果均提示做好消毒隔离及医务人员的手卫生工作可有效降低多重耐药菌的医院感染发生率，这与国内外相关报道一致[11]。一项多中心前瞻性病例对照研究多因素分析显示，入住ICU、腹部侵袭性手术、放疗/化疗、CR-KP除肠道外其他定植位点的数量是CR-KP肠道定植者发生CR-KP血流感染的独立危险因素[12]。肠道手术增加CRE肠道定植菌入血机会，造成血流感染，其预后差，病死率高[13-14]。早期识别，主动筛查定植患者，能控制病原菌的传播，降低病死率。

CR-KP的治疗一直是临床抗感染的难题，本组资料中1例腹腔感染患者最初经验性使用亚胺培南1.0 g 1次/6 h 静脉滴注，随着病情发展联合替加环素维持剂量50 mg 1次/12h，2例肺部感染患者莫西沙星治疗效果不佳后联合使用亚胺培南，并积极治疗原发疾病和并发症、把握呼吸机的撤离时机、给予合理的营养支持后病情好转。个别患者因现有资料有限，尚需进一步调查研究。相关研究表明，多黏菌素、替加环素的体外抗菌活性较高，单一用药效果往往不满意，联合碳青霉烯类等抗生素治疗CRE感染可提高疗效[15-18]，另外多黏菌素联合碳青霉烯类治疗也可减少质粒介导的多黏菌素耐药性[19]。头孢地尔[20]、头孢他啶-阿维巴坦、美罗培南-vaborbactam[20]、头孢吡肟-enmetazobactam和头孢吡肟-taniborbactam[21]将作为治疗CRE的新型药物。

综上所述，我院ICU中CR-KP耐药形势严峻，应加强抗菌药物的管控、提高医务人员手卫生的依从性、主动筛查、尽早识别CRE携带者或感染者，避免耐药菌的克隆传播，从而遏制耐药菌株在医院传播流行。