基于ITS序列的DNA条形码技术鉴定红豆杉属植物

尹文秀 ，张明哲，楼成杰，王金砖，于文涛，胡美玲，吴 姗，虞惠贞，许 瑾，张晓峰，李明福

（1.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016；2.南京市产品质量监督检验院，江苏 南京 210000；3.福州海关，福建 福州 350001；4.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

红豆杉属Taxus植物隶属于红豆杉科Taxaceae，为常绿乔木或灌木，是第三纪孑遗植物[1]，含有多种药用成分[2]。红豆杉属植物广泛分布于欧洲、北美洲及东亚等北半球地区，在全世界有11种，分别为球果红豆杉T.globosa，短叶红豆杉T.brevifolia，欧洲红豆杉T.baccata，加拿大红豆杉T.canadensis，佛罗里达红豆杉T.floridana和曼地亚红豆杉T.×Media[2]。我国有3种2变种，即密叶红豆杉T.funana，东北红豆杉T.cuspidata，西藏红豆杉T.wallichiana，红豆杉T.wallichianavar.chinensis和南方红豆杉T.wallichianavar.maire[3-4]，均为《国家重点保护野生植物名录（第一批）》中的I级重点保护野生植物[5]。

近年来，红豆杉属植物的药用价值得到了广泛关注和深入研究。1971年，首次从短叶红豆杉树皮中提取出的紫杉醇，是迄今为止最成功的抗癌药物之一[6-7]，然而红豆杉属树种耐荫性强，在天然林中生长缓慢，分布星散，野生树木更是日渐减少[8]。红豆杉物种有限的自然资源限制了紫杉醇的提取[9-10]，供需矛盾日益突出。为更好地加强对红豆杉属植物的保护和利用，开展准确鉴定必不可少。DNA条形码技术（DNA barcoding）是利用标准的一个或多个DNA片段进行物种鉴定及探索其亲缘进化关系的方法[11-13]，刘洁等选取了rbcl，matk，trnH-psbA，trnL-F和internal transcribed spacer（ITS）5对引物对欧洲和亚洲的红豆杉进行鉴别，结果表明trnl-F和ITS这两对引物可单独使用或者结合起来对欧洲和亚洲红豆杉进行鉴别[14]。本研究采用DNA条形码技术开展对红豆杉属植物的准确鉴定，依据刘洁等的实验结果并结合蒋敏捷等的方法[14-15]，选用ITS1-18S开展红豆杉属植物的鉴别，可直接区分南方红豆杉、东北红豆杉和欧洲红豆杉3种红豆杉属植物。此研究为口岸快速筛查和鉴定提供了新型的技术方法，方法便捷可靠，同时对促进物种资源的保护和利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

于2017年3月，先后于上海植物园、杭州植物园、南京植物园和浙江省林业科学研究院进行采样，每棵树采集一年生新鲜枝条1份。于上海植物园采集南方红豆杉样品1份，编号为H1；采集东北红豆杉样品1份，编号为D1；采集欧洲红豆杉样品1份，编号为EU1。于杭州植物园采集南方红豆杉样品1份，编号为H2。于南京植物园采集南方红豆杉样品1份，编号为H3，采集欧洲红豆杉样品1份，编号为EU2。于浙江省林业科学研究院采集南方红豆杉样品1份，编号为H4。于截获入境东北红豆杉盆栽采集样品1份，编号为D2。采集到样品共计8份。实验样品从采集的枝条上随机选取叶片，清洗干净进行实验。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）试剂盒开展DNA提取。样品前处理需对供试样品表面进行酒精喷洒消毒，然后将植物叶片在室温下研磨成粉末状，后参照试剂盒说明书继续操作。提取之前按照试剂盒的要求，先将Qiagen试剂盒中的Buffer AP1置于65℃水浴锅中预热。

1.2.2 PCR扩增和测序 扩增 ITS1-18S序列正向引物：5’-GCGGTAGGATCATTGTCG-3’，反向引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR扩增体系为试剂20 μL体系[大连宝生物（TaKaRa Ex Taq）提供]，10×Ex Taq Buffer 2.0 μL（Mg2+plus），dNTPs 1.6 μL（2.5 mmol·L-1），引物各0.4 μL（20 μmol·L-1），ddH2O 13.5 μL，Taq酶0.1 μL （5 U·μL-1），DNA模板2 μL（10～ 30 ng·μL-1）。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经纯化后，送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行双向测序。

1.2.3 序列比对和系统发育分析 同一采集地样品名称相同的不同株样品其序列相近[16]，所以每个采集地同一物种采集一个样品进行序列比对。样品包括南方红豆杉4个，H1，H2，H3，H4；东北红豆杉2个，D1，D2；欧洲红豆杉2个，EU1，EU2。用DNAMAN（Version 6.0.3.99）软件对所得序列进行多重比对。同时从GenBank中获得的与样品ITS1-18S序列同源性高的序列（见表1），对这些序列进行系统发育树分析，其中，加入作为外群的红豆杉科白豆杉属Pseudotaxus植物白豆杉P.chienii。

采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建ITS1-18S序列的系统进化树（boostrap1 000次重复）。

表1 从GenBank获取ITS1-18S序列物种名称及其登录号Table 1 The names and the accessions of ITS1-18S sequences of relative species from GenBank

2 结果与分析

2.1 ITS1-18 S序列扩增结果

本文依据刘洁等的实验结果并结合蒋敏捷等的方法[14-15]合成通用引物ITS1-18S（表1），选取同一采集地的不同样品H1，D1和EU1进行PCR扩增，扩增长度约为1 100 bp左右，如图1所示。

2.2 序列比对结果分析

将测序所得样品的ITS1-18S序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，结果显示，H1，H2，H3，H4；D1，D2和EU1，EU2样品的ITS1-18S序列分别与南方红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉的ITS1-18S序列的最大匹配率达到99%～ 100%。

将H1，H2，H3，H4；D1，D2和EU1，EU2样品的ITS1-18S序列与红豆杉属3个种的6条序列进行同源序列比对，舍去两端未对应的序列，共获得1 009 bp序列信息，其中包括27个变异位点（图2）；序列比对结果发现，所测未知样品ITS1-18S序列分别与红豆杉属序列相似性最高，达到99%～ 100%，遗传距离最小，为0.00～ 0.01。可以看出，H1，H2，H3，H4样品与南方红豆杉的关系比较近，D1，D2样品与东北红豆杉的关系比较近，EU1，EU2样品与欧洲红豆杉的关系比较近。

图1 H1，D1 和EU1 的PCR扩增结果Figure 1 PCR amplification result of sample H,D and EUe EU

2.3 构建系统进化树

通过DNAMAN软件，采用邻接法构建ITS1-18S序列的系统进化树，经1 000次重复抽样检测其置信度。从构建的进化树（图3）可以看出，同一物种的红豆杉属植物均能聚集在同一分支内，且均获得较高的支持率（＞90%）。其中，样品H1，H2，H3，H4与南方红豆杉ITS1-18S序列聚为一枝，EU1，EU2与欧洲红豆杉ITS1-18S序列聚为一枝，其bootstrap values分别为99%和95%。D1，D2与东北红豆杉ITS1-18S序列聚为一枝；白豆杉单独一枝。

3 结论与讨论

将不同采集地的H1，H2，H3，H4样品，D1，D2样品和EU1，EU2样品分别与南方红豆杉、东北红豆杉和欧洲红豆杉3个种的6条序列进行同源序列比对，结果表明，所测样品的ITS1-18S序列分别与红豆杉属的南方红豆杉、东北红豆杉和欧洲红豆杉序列相似性最高，达到99%～ 100%，遗传距离最小，为0～ 0.01。而且从构建的ITS1-18S序列的系统进化树也可以看出，H1，H2，H3，H4样品和南方红豆杉聚为一枝；D1，D2样品与东北红豆杉聚为一枝；EU1，EU2样品与欧洲红豆杉聚为一枝；白豆杉单独一枝。根据以上实验结果可以判定H1，H2，H3，H4样品为南方红豆杉；D1，D2样品为东北红豆杉；EU1，EU2样品为欧洲红豆杉。实验结果表明，各样品的树种与采集地样品的信息完全一致，通过ITS1-18S引物可以从分子水平对红豆杉属植物进行区分和鉴定，此方法切实可行。

图2 红豆杉属ITS1-18S序列比对结果Figure 2 Sequence alignment of ITS1-18S of Taxus

DNA条形码技术是传统鉴定方法的有效补充，此方法不受个体形态、大小等特征和完整性的影响，也就避免了形态学鉴定中存在的局限性，能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据，可有效区分种间差异[11]。张明哲等设计了南方红豆杉的特异性引物和探针，通过实时荧光PCR方法鉴别南方红豆杉，但该引物探针仅能鉴定南方红豆杉和其原始种西藏红豆杉，而无法对红豆杉属其他种进行区分[17]。而本研究基于真核生物的核糖体基因rRNA的内转录间隔区（ITS）的高保守性选取ITS序列进行植物物种的分子鉴定，通过DNA条形码技术可对未知植物样品进行筛选，可快速将物种范围锁定至红豆杉属，弥补了南方红豆杉特异性引物探针局限性的缺陷。我国红豆杉属植物大部分位列于濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）附录Ⅱ中[18]。所以此法可建立快速、简便、准确、适合于口岸查验的鉴定方法，有效保护和利用生物资源。后期可进一步研究探索，在初筛结果上结合红豆杉属不同种间的形态学特征进行鉴定或设计红豆杉属不同种的特异性引物探针进行实时荧光PCR方法鉴别。

图3 基于ITS1-18S序列构建红豆杉科间的系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree of Taxaceae by ITS1-18S sequences