利用基因组编辑技术构建拟南芥双突变体iqm5-1 flc

李惠梅 范甜 吕天晓 周玉萍 田长恩

摘 要

本研究组前期发现，拟南芥IQM5基因突变引起开花推迟，可能是提升了开花抑制因子FLC的转录本水平所致。然而 ，缺乏遗传学证据。本实验利用基因组编辑技术构建FLC的编辑载体，转化IQM5基因的T-DNA插入突变体iqm5-1，通过抗生素抗性筛选和测序得到双突变体iqm5-1 flc，为确定IQM5通过FLC调控开花提供了遗传材料。

关键词

IQM5;FLC;基因组编辑;双突变体;拟南芥

中图分类号： Q943.2                    文献标识码： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457 . 2020 . 14 . 67

拟南芥的IQM家族共有6个成员， N-端有一段序列与豌豆重金属诱导蛋白同源， C-端则有一段与核糖体失活蛋白天花粉素同源的序列。IQM家族各成员可能在不同环境条件和不同发育阶段所起作用各不相同[1-2]。本研究组发现在幼苗、茎、莲座叶、花序叶和花蕾中，均存在 IQM5.1 和 IQM5.2 的两种转录本，不过，不同组织器官中二者的比例不尽相同[3]。在拟南芥中，已探明春化、光周期、赤霉素、年龄途经、自主以及温度等6条调控开花时间的遗传途径。开花抑制因子FLC能直接抑制包括FT、SOC1和FD在内的开花整合基因的表达[4]。本研究组发现，IQM5的T-DNA插入突变体iqm5-1和iqm5-2在长日照或短日照下均呈现晚花表型;FLC在野生型植株的茎、叶中均微弱表达，但在突变体iqm5-1和iqm5-2的茎、叶中表达量均显著增高[5]。因此，推断IQM5基因突变引起开花推迟，可能是提升了开花抑制因子FLC的转录本水平所致[5]。本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建双突变体iqm5-1 flc，为确定IQM5通过FLC调控开花提供遗传材料。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

植物材料：iqm5-1（CSHL_GT18219）是Landsberg erecta（Ler）生态型的IQM5 T-DNA 插入突变体，来源于Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， USA。载体：pYLsgRNA-AtU3d、pYLsgRNA-AtU3b、pYLCRISPR/ Cas9-Pubi-H菌种由华南农业大学刘耀光院士友好赠送。菌种：大肠杆菌E.coli DH5α及农杆菌GV3101菌株均由本实验室保藏。试剂：Bsa I核酸内切酶购于NEB公司，其他试剂盒与工具酶均购自TAKARA生物工程有限公司;MS盐（Murashige&Skoog ）购自Sigma公司;潮霉素、Yeast Extract、Typtone和Agar M等为生工生物工程（上海）有限公司产品 。测序及引物合成：由生工生物工程（上海）有限公司及完成。引物序列 （均为5′→3′）：SP-L1：GCGGTGTCATCTATGTTACTAG，SP-R：CGACATAGATGCAATAACTTCG;3D-FLC-F：GTCACCTTCTCCAAACGTCGCAA，3D-FLC-R：AAACTTGCGACGTTTGGAGAAGG;3B-FLC-F：GTCAGGAGAAGCTGTAGAGCTTGC，3B-FLC-R：AAACGCAAGCTCTACAGCTTCTCC;Cas9-FLC-F：GCGGTACACGTGGCAATCTT，Cas9-FLC-R：ACAACATCGAGCACGCATCA。

1.2 实验方法

质粒提取、PCR、酶切、DNA片段回收与纯化方法参照对应试剂盒说明书进行。载体构建参考CRISPR/Cas9基因编辑技术方法[6]进行：在FLC基因中设计2对靶点接头3D-FLC-F/R和3B-FLC-F/R，分别退火连成小片段，重组插入经BsaI线性化的载体pYLsgRNA-AtU3d和pYLsgRNA-AtU3b中;经gRNA表达盒扩增后重组入经BsaI线性化的双元载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H;热激转化大肠杆菌，经菌落PCR鉴定及测序验证后提取质粒转化农杆菌，再利用农杆菌蘸花法转化突变体iqm5-1;收获成熟种子，经潮霉素抗性筛选得到T0代幼苗，移至土壤培養;在靶点上下游设计引物Cas9-FLC-F/R进行PCR扩增和测序，筛选基因编辑成功株系，在后代中继续筛选纯合转化植株。

2 结果与分析

本研究利用CRISPR/Cas9对拟南芥iqm5-1的FLC基因进行编辑。首先，分别将靶点接头3D-FLC-F/R和3B-FLC-F/R退火连成小片段，插入pYLsgRNA-AtU3d-FLC和pYLsgRNA-AtU3b-FLC，经gRNA表达盒扩增，得到预期产物（图1-A）。其次，将扩增产物插入线性化的pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H后转化大肠杆菌，挑选抗性菌落进行PCR鉴定，获得阳性菌落（图1-B）;进一步，从阳性菌落提取质粒，转化农杆菌，菌落PCR鉴定结果符合预期（图1-C）;最后，利用农杆菌转化拟南芥突变体iqm5-1，收获种子经潮霉素抗性筛选获得候选植株，对其进行PCR鉴定获得预期产物（图1-D），外送测序获得预期的基因组编辑植株。

将上述候选编辑植株后代继续进行抗性筛选和序列分析，成功获得1株纯合双突变体iqm5-1 flc。在该双突变体中，iqm5-1 已经报道[5];flc的突变如图2所示：从FLC起始密码子ATG的A开始，在第74与第75位碱基间插入1个碱基（T），该碱基的插入导致其后序列发生移码突变，并提前终止，产生仅有39个氨基酸残基的突变蛋白，而野生型FLC有196个氨基酸残基。

3 讨论

本研究组前期发现，IQM5 的2个T-DNA插入突变体iqm5-1和iqm5-2在长日照或短日照条件下均呈现晚花表型，且其茎、叶中FLC的表达量均显著增高。因此，IQM5基因突变可能通过提升开花抑制因子FLC的转录本水平而实现[5]。不过，缺乏遗传材料。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术方法，成功编辑了突变体iqm5-1中的FLC基因，筛选得到双突变体iqm5-1 flc，为确定IQM5通过FLC调控开花提供了遗传材料。

参考文献

[1] 田长恩， 周玉萍. 植物具IQ基序的钙调素结合蛋白的研究进展[J]. 植物学报， 2013，48 （4）： 447-460.

[2] ZhouYP， Chen YZ， Yamamoto KT， Duan J， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J]. Acta Physiol Plant， 2010，32： 191–198.

[3] 弓路平， 萧文慧， 周玉萍，黄小玲，田长恩. 拟南芥 IQM5.2 的克隆、表达及生物信息学分析[J].生物技术通报，2016，32（5）：69-74.

[4]張艺能， 周玉萍， 陈琼华，黄小玲，田长恩. 拟南芥开花时间调控的分子基础[J]. 植物学报，2014， 49 （4）： 469–482.

[5] Gong LP， Cheng JZ， Zhou YP， Huang XL， Tian CE. Disruption of IQM5 delays flowering possibly through modulating the juvenile-to-adult transition[J].Acta Physiol Plant，2017，39：21.1-10.

[6] Ma XL， Liu YG. CRISPR/Cas9-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Curr  Protoc Mol  Biol ， 2016， 115：31.6.1-31.6.21.